PathoDx PathoDx R62230 Mode d'emploi

des monocouches cellulaires 48 heures après l’inoculation
d’un échantillon clinique. Les anticorps monoclonaux marqués
à la fluorescéine reconnaissent les deux protéines majeures
de membrane externe (MOMP) de tous les sérovars de
C. trachomatis et les lipopolysaccharides (LPS) de Chlamydia
spécifiques au genre.
PathoDx
Chlamydia Culture
Confirmation Kit
R62210
FR
1. Domaine D’APPLICATION
PathoDxTM Chlamydia Culture Confirmation est un test
d’immunofluorescence conçu pour la détection et l’identification
du genre Chlamydia après prolifération dans une culture de tissus.
Lorsque le conjugué d’anticorps est ajouté à une lamelle de
protection contenant des cellules de culture tissulaire fixées à
l’éthanol, le réactif se lie de manière spécifique aux inclusions
de chlamydiae présentes dans les cellules. Une étape de lavage
permet d’éliminer le conjugué d’anticorps non lié. Lorsque la
lamelle de protection colorée est examinée au microscope à
fluorescence, de grosses inclusions brillantes, de couleur vert
pomme, sont observées dans les cellules infectées sur un fond de
cellules contre-colorées en rouge.
2. RESUME ET EXPLICATION Du Test
Les chlamydiae sont les agents étiologiques les plus courants
dans les maladies sexuellement transmissibles.15 Les chlamydiae
sont des organismes intracellulaires obligatoires non mobiles,
dont les parois cellulaires sont similaires à celles des bactéries à
Gram négatif.12,13 Le genre Chlamydia se divise en trois espèces
: C. trachomatis, C. psittaci et C. pneumoniae, qui ont tous en
commun un antigène de type lipopolysaccharide (LPS).18
4. Reactifs
CONTENU DU KIT
C. trachomatis provoque des infections graves et souvent
asymptomatiques chez l’homme.7 Chez la femme, il est souvent
responsable de la cervicite ou de la maladie inflammatoire
pelvienne (MIP),3,4,16 chez l’homme, de l’urétrite non
gonococcique et de l’épididymite,2,8,12 ainsi que de la conjonctivite
à inclusions et de la pneumonie chez le nouveau-né.1,5 C. psittaci
est essentiellement un agent pathogène animal mais il peut
provoquer des infections chez l’homme, généralement suite à une
exposition à des espèces aviaires infectées. C. pneumoniae est
une espèce récemment décrite comme responsable d’infections
respiratoires aiguës, notamment la pneumonie.
DESCRIPTION, PREPARATION POUR UTILISATION ET CONDITIONS
DE CONSERVATION RECOMMANDEES
Les chlamydiae se propagent en cultures de tissus grâce à un
traitement chimique des cultures cellulaires visant à optimiser
la sensibilité des cellules hôtes pour l’infection.14 Actuellement,
plusieurs méthodes diagnostiques sont disponibles pour
détecter C. trachomatis dans des échantillons cliniques. Les tests
immunoenzymatiques et par immunofluorescence permettent
de détecter les antigènes de chlamydiae directement dans les
échantillons cliniques. Les cultures cellulaires infectées par les
chlamydiae peuvent être colorées avec des anticorps conjugués
à l’iode, au colorant Giemsa ou à la fluorescéine.12‑14
Les chlamydiae existent sous deux formes : un type de cellule
infectieuse, appelée corps élémentaire et un type de cellule
reproductive, appelé corps réticulé. Le cycle de croissance des
chlamydiae commence par l’attachement et l’entrée des corps
élémentaires dans le cytoplasme des cellules hôtes. Les corps
élémentaires subissent alors des modifications morphologiques
et forment des corps réticulés non infectieux, qui se divisent
par fission binaire, ce qui constitue les inclusions.6,14 Les corps
réticulés continuent à se condenser et à se réorganiser, pour se
transformer finalement en corps élémentaires, libérés par lyse
cellulaire.10,12,13
3. PRINCIPE De La Methode
Le kit PathoDx Chlamydia Culture Confirmation utilise des
anticorps murins monoclonaux conjugués à la fluorescéine
pour colorer les inclusions et/ou les corps élémentaires dans
Chlamydia Culture Confirmation Kit
100 tests (R62210)
1.
Réactif de confirmation de la chlamydia 1 flacon compte-gouttes
(bouchon turquoise)
2.
Fluide de montage (R62230)
1 flacon compte-gouttes
(bouchon noir)
3.
Mode d’emploi
1
Se référer également au paragraphe Précautions et restrictions
d’emploi.
Conserver entre 2 et 8°C. Ne pas utiliser après la date de péremption
indiquée sur l’emballage. Amener le réactif à température
ambiante (entre 15 et 28°C) avant utilisation et bien mélanger en
retournant doucement le flacon. Les anticorps monoclonaux sont
prêts à l’emploi. Aucune dilution supplémentaire n’est nécessaire.
Réactif de confirmation de la chlamydia
Un flacon compte-gouttes en plastique
contenant 5,5 ml d’anticorps monoclonaux
murins purifiés marqués à la fluorescéine, du
contre-colorant bleu d’Evans, un inhibiteur
de coloration non spécifique, et 0,098%
d’azide de sodium dans une solution tampon
stabilisée avec des protéines.
Fluide de montage
Un flacon compte-gouttes en plastique
contenant 5,0 ml de liquide de montage,
composé de glycérol tamponné, avec 0,01%
d’azide de sodium comme conservateur.
5. PRECAUTIONS ET RESTRICTIONS D’EMPLOI
Les réactifs sont destinés exclusivement au diagnostic in vitro.
Réservé à un usage professionnel.
Pour obtenir des informations sur les composants potentiellement
dangereux, se référer à la fiche de sécurité fournie par le fabricant
et à l’étiquetage du produit.
INFORMATIONS DE SECURITE
1.
L’azide de sodium (moins de 0,1%) a été ajouté aux réactifs
comme agent antibactérien. Pour prévenir l’accumulation
d’azides métalliques explosifs dans les canalisations en
plomb et en cuivre, les réactifs ne doivent être déversés
dans le système d’égouts que s’ils sont dilués et mélangés
à de grands volumes d’eau. Il est préférable d’utiliser des
canalisations sans cuivre et sans plomb.
2.
Échantillons cliniques : Les précautions de sécurité adaptées
doivent être respectées lors de la manipulation et du
traitement des échantillons cliniques car ils peuvent contenir
des organismes vivants pathogènes. Les bonnes pratiques
de laboratoire doivent être suivies lors de la manipulation
des cultures pouvant contenir des virus infectieux.
3.
Déchets : Stériliser tous les déchets avant de les jeter,
en suivant les procédures propres au laboratoire et les
réglementations locales.
4.
Présence du colorant bleu Evans dans le réactif. Bien que
le produit soit en concentrations inférieures à celles qui
requièrent qu’on le classe comme cancérogène, éviter tout
contact avec la peau.
PRECAUTIONS D’ANALYSE
Ce produit ne doit pas être utilisé si (1) la couleur du réactif a
changé, (2) la date de péremption est dépassée ou (3) s’il présente
d’autres signes de détérioration.
6. PRELEVEMENT, CONSERVATION ET TRANSPORT DES
ECHANTILLONS
Prélèvement et culture des échantillons
Prélever les échantillons du patient de manière appropriée selon
le site anatomique infecté, les placer dans un milieu de transport
adapté et les envoyer au laboratoire pour analyse. Le milieu de
transport ne doit pas inhiber la croissance de Chlamydia spp.
ou des cellules en culture. Inoculer une monocouche de cellules
McCoy ou HeLa 229 avec l’échantillon du patient, selon une
méthode approuvée.6,9,11,14 La coloration peut être effectuée
48 heures après l’inoculation.
En complément de chaque lot d’échantillons de patients, il est
recommandé de traiter les cellules infectées par la Chlamydia et
les cellules en culture non infectées comme contrôles positif et
négatif.
Les échantillons peuvent être conservés entre 2 et 8°C pendant 24
heures maximum après le prélèvement, sans perte conséquente du
pouvoir infectieux. Pour de meilleurs résultats, il est recommandé
de traiter les échantillons immédiatement. Une conservation de
plus de 24 heures requiert une température ne dépassant pas
-70°C. Au cours du transport, conserver l’échantillon à la même
température que celle utilisée pour la conservation.
7. Procedure
MATERIEL FOURNI
Le kit Chlamydia Culture Confirmation (R62210) permet la
réalisation de 100 tests (voir Contenu du kit).
MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI
1.
2.
3.
Microscope à fluorescence avec le système de filtre
adapté à l’isothiocyanate de fluorescéine (longueur d’onde
d’excitation maximum = 490 nm ; émission maximum = 520
nm ; objectifs grossissants de 100X et de 400 à 500X)
Eau déminéralisée ou PBS à 0,05 M
Gros écouvillons en coton ou en polyester (pour nettoyer
l’exocol)
Écouvillons de prélèvement stériles (qui n’inhibent pas la
prolifération de Chlamydia spp.)
5.
Milieu de transport pour Chlamydia
6.
Milieu d’isolement de Chlamydia contenant du cycloheximide
7.
Tubes shell vial (verre ; 1,77 gramme)
8.
Cellules McCoy ou HeLa 229 - pour les échantillons
de patients, et comme contrôles positif et négatif
(recommandé)
9.
Centrifugeuse
10. Éthanol à 95% (qualité réactif)
11. Pince
12. Lames de microscope
13. Lamelles de protection (12 mm de diamètre)
14. Papier buvard pour les lames
15. Bécher ou jarre de Coplin (pour rincer les lamelles de
protection)
16. Incubateur (37°C)
17. Chambre humide
PROCEDURE DU TEST
Fixation
Etape 1
Enlever le milieu des flacons inoculés et ajouter
immédiatement de l’éthanol à 95% en quantité
suffisante pour recouvrir complètement la
monocouche. Laisser reposer pendant 1 à
10 minutes.
Etape 2
Aspirer l’éthanol et retirer les lamelles de protection
à l’aide de la pince. Poser la tranche de la lamelle de
protection sur du papier buvard pour enlever l’excès
d’éthanol.
Etape 3
Placer la lamelle de protection, cellules vers le haut,
sur une lame de microscope propre et étiquetée.
Les lamelles de protection doivent être colorées
dans les 24 heures. Si la coloration ne peut être
effectuée dans ce délai, conserver la lamelle de
protection dans un tube shell vial avec de l’éthanol
à -70°C.
Coloration
Les monocouches cellulaires doivent demeurer
humides à toutes les étapes de la procédure. Le
réactif de confirmation de la chlamydia doit être
stocké à température ambiante (15-28°C) avant
utilisation. Bien mélanger le réactif de confirmation
de la chlamydia avant utilisation, en retournant
doucement le flacon.
Etape 1
Ajouter une goutte de réactif de confirmation de la
chlamydia sur les cellules fixées. Ne pas ajouter de
réactif sur une monocouche complètement sèche;
toujours réhumidifier les cellules avec du PBS ou de
l’eau déminéralisée avant d’ajouter le réactif pour
garantir que la monocouche sera complètement
recouverte.
Etape 2
Placer les lames dans une chambre humide et laisser
incuber pendant 30 minutes à 37°C. Ne pas laisser
l’anticorps sécher sur la lamelle de protection, sous
peine d’obtenir une coloration non spécifique.
4.
Etape 3
À l’aide de la pince, bien rincer les lamelles de
protection en les agitant pendant 10 à 15 secondes
dans un bécher ou une jarre de Coplin rempli d’eau
déminéralisée ou de PBS. Poser la tranche de la
lamelle de protection sur du papier buvard pour
enlever l’excès d’humidité.
Etape 4
Ajouter une goutte de fluide de montage sur une
lame de microscope propre. Retourner la lamelle
de protection et la placer, cellules vers le bas, sur le
liquide de montage. Enlever les bulles d’air.
Etape 5
Examiner les lames immédiatement après
coloration à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Examiner les monocouches au grossissement de
100X, et confirmer la morphologie au grossissement
de 400X à 500X. S’il est nécessaire de retarder la
lecture, conserver les lames après montage entre 2
et 8°C et à l’obscurité. Pour des meilleurs résultats,
les lames doivent être lues dans les 24 heures. Noter
que sur les lames portant un conjugué marqué à la
fluorescéine, la couleur s’affaiblit lorsqu’elles sont
exposées à la lumière. Laisser les lames atteindre la
température ambiante avant lecture.
Procédure de coloration optionnelle des lamelles de protection
dans les tubes shell vial
Etape 1
Suivre l’étape 1 de la procédure de fixation comme
indiqué ci-dessus. Aspirer l’éthanol après 10
minutes.
Etape 2
Ajouter du réactif de confirmation de la chlamydia
(environ 3-4 gouttes) en quantité suffisante pour
couvrir la lamelle de protection. Reboucher le tube
shell vial et incuber pendant 30 minutes à 37°C.
Etape 3
Laver la lamelle de protection deux fois à l’eau
déminéralisée ou distillée ou dans du PBS 0,05 M.
Etape 4
Ajouter une goutte de liquide de montage sur une
lame de microscope propre. À l’aide de la pince,
enlever la lamelle de protection du tube shell vial.
Poser la tranche de la lamelle de protection sur du
papier buvard pour enlever l’excès d’humidité et la
placer, cellules vers le bas, sur le liquide de montage.
Etape 5
Suivre l’étape 5 de la procédure de coloration
comme indiqué ci-dessus.
8. CONTROLE QUALITE
En complément de chaque lot d’échantillons de patients, il est
recommandé de traiter les cellules infectées par la Chlamydia
et les cellules en culture non infectées comme contrôles positif
et négatif respectivement, afin de vérifier les performances du
microscope, du système de culture et des réactifs. Les résultats
du test sont acceptables uniquement si les cellules de culture
infectées par la Chlamydia contiennent elles aussi des inclusions
apparaissant en fluorescence vert brillant par rapport à une
monocouche contre-colorée en rouge foncé, et si les cellules non
infectées ne présentent pas d’inclusions vert brillant.
9. INTERPRETATION
Résultats positifs
Les cultures fixées et colorées qui sont positives aux chlamydiae
contiennent des inclusions qui apparaissent en fluorescence vert
pomme, contre des cellules en monocouche contre-colorées
en rouge foncé. La taille des inclusions varie en fonction des
conditions de culture et du sérovar. La présence d’une inclusion
suffit à donner un résultat positif.
Des exemples d’inclusions de chlamydiae colorées à la
fluorescéine peuvent être consultés dans les publications
scientifiques.17 Cependant, selon les anticorps monoclonaux
marqués à la fluorescéine, le motif de fluorescence peut varier.
Résultats négatifs
Les cultures fixées sont considérées comme négatives
lorsqu’aucune inclusion vert brillant n’est détectée dans la
monocouche de cellules contre-colorées en rouge foncé.
10. LIMITES
1.
La détection des Chlamydiae dans les échantillons mis
en culture dépend de la qualité du prélèvement des
échantillons, du transport, de la technique de culture des
tissus et de a préparation des lames.
2.
Le kit PathoDx Chlamydia Culture Confirmation a été testé
uniquement pour une utilisation lors de la détection et de
l’identification de Chlamydia dans des cultures de tissus.
3.
Aucune donnée n’est disponible concernant les performances
du kit PathoDx Chlamydia sur des échantillons de patients
recueillis pendant ou après un traitement antibiotique.
4.
Les monocouches cellulaires doivent demeurer humides
à toutes les étapes de la procédure de confirmation par
culture.
5.
Le réactif de travail (Réactif de confirmation de la chlamydia)
est prêt à l’emploi et est optimisé pour détecter les espèces
connues de Chlamydia. Une dilution ou toute autre
altération du réactif de travail peut provoquer une perte
de sensibilité.
6.
Ce test ne permet pas de différencier les espèces de
Chlamydia ou les sérovars de Chlamydia trachomatis.
11. CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE
Essais cliniques
Les évaluations cliniques ont été menées dans deux laboratoires
indépendants pour comparer les performances du kit PathoDx
Chlamydia Culture Confirmation à celles du C. trachomatis
Culture Confirmation Test MicroTrak®. Chaque site d’investigation
a analysé des échantillons cliniques n’ayant pas été diagnostiqués
auparavant, mis en culture cellulaire monocouche McCoy à 35°C.
Les monocouches ont ensuite été fixées, colorées et examinées
conformément aux procédures indiquées dans les notices
PathoDx et MicroTrak® correspondantes.
Au total, 250 échantillons cliniques ont été analysés. Sur le
site numéro un, 87 échantillons prélevés au niveau du col de
l’utérus et 13 échantillons prélevés au niveau de l’urètre ont été
recueillis sur un écouvillon, chez 100 adolescents ayant une vie
sexuelle active, âgés de 12 à 20 ans. Parmi ces 100 adolescents,
la prévalence d’infection aux chlamydiae était de 24%. Sur le
site numéro deux, 98 et 52 échantillons ont été prélevés chez
des adultes, respectivement au niveau du col de l’utérus et de
l’urètre. Parmi ces 150 adultes, la prévalence de l’infection aux
chlamydiae était de 39%. Les résultats combinés des deux sites
apparaissent ci-dessous.
Dans l’ensemble, le test PathoDx était sensible à 100% et
spécifique à 100%.
­
­
PathoDx­­
­
­
MicroTrak­®
Pos.­
Nég.­
Pos.­
82­
0­
Nég.­
0­
168­
Spécificité
Pour établir la réactivité spécifique du genre du réactif de
confirmation de la chlamydia PathoDx, des espèces connues du
genre Chlamydia, notamment C. psittaci et les 15 sérovars connus
de C. trachomatis ont été testés. Toutes les espèces de Chlamydia
ont présenté une coloration à la fluorescéine.
9.
Afin de vérifier la spécificité du kit PathoDx Chlamydia Culture
Confirmation, des organismes bactériens, fongiques et viraux
ont été testés pour déterminer la réactivité croisée (voir tableau
ci-dessous). Les micro-organismes ont été mis en culture
dans un bouillon et 10 µl d’une suspension contenant 1 × 109
unités formant colonie par millilitre, ou sur des monocouches
cellulaires infectées par un virus avec une multiplicité d’infection
MOI inférieure à 0,01 ; ils ont ensuite été fixés sur une lame
conformément à la procédure indiquée dans le présent document.
Aucun des organismes testés n’a montré de réactivité croisée.
14. Sierra, M.F., et al. 1988. Lab. Med. 19:311-314.
Micro-organisme­
Acinetobacter baumannii­
Candida albicans­
Candida tropicalis­
Cytomégalovirus­
Enterococcus faecalis­
Escherichia coli­
Haemophilus influenzae Type A­
Virus Herpes Simplex, type I­
Virus Herpes Simplex, type II­
Klebsiella pneumoniae­
Lactobacillus acidophilus­
Lactobacillus casei­
Moraxella osloensis­
Mycoplasma genitalium­
Mycoplasma hominis­
Neisseria gonorrhoeae­
Neisseria gonorrhoeae­
Neisseria gonorrhoeae­
Neisseria meningitidis Groupe A­
Neisseria meningitidis Groupe B­
Neisseria meningitidis Groupe C­
Neisseria meningitidis Groupe D­
Neisseria sicca­
Proteus mirabilis­
Proteus vulgaris­
Pseudomonas aeruginosa­
Salmonella minnesota­
Salmonella typhi­
Salmonella typhimurium­
Staphylococcus aureus Cowan I­
Staphylococcus epidermidis­
Streptococcus agalactiae­
Streptococcus pyogenes­
Souche­
ATCC® 17904­
166 Nelson/CA­
PN 1164­
AD169­
PN 1120­
ATCC® 29194­
AANEN 1217­
MacIntyre­
MS­
33495­
PN 1126­
PN 1078­
PN 1339­
ATCC® 33530­
ATCC® 23114­
PN 1138­
PN 1177­
PN 1282­
ATCC® 13077­
ATCC® 13090­
ATCC® 13102­
ATCC® 13113­
PN 1101­
ATCC® 25933­
PN 1062­
PN 1280­
R 595­
ATCC® 6539­
ATCC® 14028­
ATCC® 12598­
PN 5204­
090R­
ATCC® 10389­
12. BIBLIOGRAPHIE
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the American Society for Microbiology. ASM, Washington, D.C.
13. CONDITIONNEMENT
R62210.................................................. 100 tests/kit
Légende des symboles
Numéro de référence
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Utilisation en laboratoire
Consulter le mode d’emploi
Limite de température
Code de lot
A utiliser avant le
Fabricant
PathoDx est une marque de commerce déposée de Remel Inc.
ATCC® est une marque de commerce déposée d’American Type
Culture Collection.
MicroTrak® est une marque de commerce déposée de PLC de
Biotech de trinité.
IFU X7784 révisé Novembre 2012
Remel Europe Ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT
UK
Pour obtenir une assistance technique, contacter le distributeur
local.
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