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MACHEREY-NAGEL Bioanalysis Biologie Moléculaire User manual Manuel d'utilisation Purification des réactions de séquençage n NucleoSEQ® Juin 2022 / Rev. 05 www.mn-net.com www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: info@mn-net.com Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-270 E-mail: tech-bio@mn-net.com USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: sales-us@mn-net.com France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: sales-fr@mn-net.com MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: sales-ch@mn-net.com www.mn-net.com Purification des réactions de séquençage Sommaire 1 Composition 4 1.1 Contenu du kit 4 1.2 Matériel à fournir par l’utilisateur 4 1.3 A propos de ce manuel d'utilisation 4 2 Description du produit 5 2.1 Principe général 5 2.2 Caractéristiques du kit 5 3 Conditions de stockage 5 4 Instructions de sécurité 5 4.1 Elimination des déchets 5 5 Protocole pour la purification de réactions de séquençage 6 6 Annexes 8 6.1 Guide de résolution des problèmes 8 6.2 Informations de commande 8 6.3 Restriction d’utilisation / garantie 9 MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 05 3 Purification des réactions de séquençage 1 Composition 1.1 Contenu du kit NucleoSEQ® 10 preps 740523.10 50 preps 740523.50 250 preps 740523.250 Colonnes NucleoSEQ® 10 50 250 Tubes collecteurs 10 50 250 Manuel d’utilisation 1 1 1 REF 1.2 • Matériel à fournir par l’utilisateur Tubes collecteurs (ex : tube 1,5 mL pour micro centrifugeuse) 1.3 A propos de ce manuel d'utilisation Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoSEQ® de lire la version détaillée du protocole. Toute la littérature technique est disponible en ligne sur www.mn-net.com. Merci de contacter notre service technique à propos de tout éventuel changement entre la version actuelle du manuel et les précédentes. 4 MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 05 Purification des réactions de séquençage 2 Description du produit 2.1 Principe général Les colonnes NucleoSEQ® sont conçues pour la purification rapide et fiable des acides nucléiques. L’utilisation de la technologie d’exclusion de gel en format miniprep à centrifuger permet de séparer efficacement les plus petites molécules des acides nucléiques. Les impuretés telles les sels, l’excès de marqueurs, de nucléotides, les traces de solvants organiques sont retenues par la colonne tandis que les acides nucléiques d’intérêt sont récupérés avec un rendement élevé. Les colonnes sont pré-conditionnées avec le gel d’exclusion de taille. 2.2 Caractéristiques du kit • Volume maximal d’échantillon chargé : 20 µl. • Elimination des dye terminators y compris BigDye®. 3 Conditions de stockage • Les colonnes NucleoSEQ® contenant la matrice sèche peuvent être stockées à température ambiante et sont stables jusqu'au : voir l'étiquette sur le kit. • Les colonnes NucleoSEQ® contenant la matrice hydratée devront être stockées à 4°C. Les colonnes peuvent être stockées jusqu’à 14 jours à 4°C. 4 Instructions de sécurité Les kits NucleoSEQ® ne contiennent aucun composant dangereux. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances usagées d'une manière sûre et conforme aux dispositions règlementaires locales. MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 05 5 NucleoSEQ® 5 Protocole pour la purification de réactions de séquençage Procédure générale (Pour les détails sur chaque étape voir page 7.) 1 Centrifuger la résine sèche 750 x g 30 s 2 3 4 5 6 Hydrater la résine avec 600 µL d’eau, vortexer et incuber au moins 30 min pour une hydratation complète Enlever le bouchon inférieur et centrifuger la résine hydratée Charger l’échantillon au centre de la résine Centrifuger 4–6 min à 750 x g pour récupérer l’échantillon purifié MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 05 600 µL eau TA > 30 min 750 x g 2 min Charger la colonne 750 x g 4–6 min NucleoSEQ® Procédure détaillée Réaliser la réaction de séquençage selon les protocoles standards. Nous recommandons de ne pas utiliser plus de 1–2 µl de mélange réactionnel Big Dye® Ready par réaction de séquençage de 20 µl afin de ne pas surcharger les colonnes. 1 Centrifuger les colonnes NucleoSEQ® pendant 30 sec à 750 x g pour collecter la matrice sèche au fond de la colonne. 2 Ajouter 600 µL d’eau distillée et mélanger au vortex pour hydrater le gel. Eliminer les bulles d’air en vortexant ou en tapotant la colonne. Incuber au moins 30 min ou toute la nuit pour hydrater la résine. L’incubation peut être effectuée à température ambiante ou à 4°C. Les colonnes hydratées peuvent être stockées à 4°C pendant 14 jours maximum. Resuspendre la matrice sédimentée en retournant ou en mélangeant au vortex la colonne plusieurs fois. Les bulles d’air doivent avoir disparues. Enlever le bouchon inférieur de la colonne et placer la dans un tube collecteur (fourni avec le kit). 3 Placer la colonne dans la centrifugeuse (la charnière du bouchon de la colonne doit être orientée vers l’extérieur du rotor). Centrifuger 2 min à 750 x g pour enlever le tampon de stockage. Eliminer le tube collecteur avec le tampon de stockage. Placer la colonne dans un tube collecteur approprié pour la collecte des échantillons purifiés (par ex. un tube 1,5 mL pour micro centrifugeuse, non fourni). 4 Ouvrir la colonne. Charger précautionneusement l’échantillon verticalement sur le centre du gel. Pipeter l’échantillon sur les bords de la colonne peut réduire l’efficacité de la purification. Par ailleurs, éviter de toucher la surface du gel. Le volume de l’échantillon ne doit pas dépasser les 20µl. 5 Placer la colonne dans le rotor de la même manière que précédemment (charnière du bouchon vers l’extérieur). Eluer l’échantillon par centrifugation de la colonne pendant 4–6 min à 750 x g. Jeter la colonne. Sécher l’échantillon ou utiliser directement. MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 05 7 Purification des réactions de séquençage 6 Annexes 6.1 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possibles et suggestions L’échantillon n’a pas été appliqué correctement sur le gel • Dye blobs Ajouter l’échantillon directement au centre du gel. Distribuer l’échantillon au goutte à goutte. Eviter de déposer l'échantillon sur les bords du gel. Volume d’échantillon trop important • Ajouter 20 µL d’échantillon. Des volumes supérieurs peuvent entraîner une élimination incomplète des dye terminators. Volume d’échantillon trop faible Faible intensité du signal • Utiliser un volume d’échantillon de 20 µL. Si nécessaire, ajuster le volume de l’échantillon à 20 µL avec de l’eau distillée. Conversion des forces de centrifugation relatives (RCF) pour différentes centrifugeuses : rpm = 100 x √ RCF / 1.12r RCF = (rpm / 1000)² x 1.12r rpm = (revolution per minute) tours par min. RCF = (relative centrifugal force) force de centrifugation relative. Force centrifuge = RCF x g. r = rayon en mm. 6.2 Informations de commande Produit ® NucleoSEQ REF Conditionnement 740523.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations plus détaillées. 8 MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 05 Purification des réactions de séquençage 6.3 Restriction d’utilisation / garantie Les composants du kit NucleoSEQ® ont été développés, conçus et vendus UNIQUEMENT À DES FINS DE RECHERCHE, à l’exception, toutefois, de toute autre fonction du produit qui est expressément décrite dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Les produits MACHEREY‑NAGEL sont destinés à une utilisation GÉNÉRALE en LABORATOIRE UNIQUEMENT ! Les produits MACHEREY‑NAGEL sont EXCLUSIVEMENT destinés à un PERSONNEL QUALIFIÉ ! Lorsqu’ils manipulent des produits MACHEREY-NAGEL, les utilisateurs doivent toujours porter des VÊTEMENTS DE PROTECTION adéquats. Pour des informations détaillées, veuillez-vous référer à la fiche de données de sécurité du produit ! Les produits MACHEREY‑NAGEL doivent être utilisés exclusivement dans un ENVIRONNEMENT DE TEST ADÉQUAT. MACHEREY‑NAGEL décline toute responsabilité pour les dommages dus à une utilisation incorrecte de ses produits dans tous autres domaines d’application. L’application sur le corps humain est STRICTEMENT INTERDITE. L’utilisateur est responsable de tous les dommages résultant d’une telle application. Les produits de purification d’ADN/ARN/PROTÉINES de MACHEREY‑NAGEL conviennent UNIQUEMENT aux UTILISATIONS IN VITRO ! SEULS les produits MACHEREY‑NAGEL portant la mention « IVD » peuvent également être utilisés pour le diagnostic IN VITRO. Veuillez prêter attention à l’emballage du produit. La mention « IVD » doit figurer expressément sur l’emballage des produits de diagnostic INVITRO. S’IL N’Y A PAS LA MENTION « IVD », LE PRODUIT NE PEUT PAS ÊTRE UTILISÉ POUR LE DIAGNOSTIC IN-VITRO ! TOUS LES AUTRES PRODUITS NE PORTANT PAS LA MENTION « IVD » NE SONT PAS ADAPTÉS À UN USAGE CLINIQUE (Y COMPRIS, MAIS SANS S’Y LIMITER, À UN USAGE DIAGNOSTIQUE, THÉRAPEUTIQUE ET/OU PRONOSTIQUE). Aucune revendication ni déclaration n’est prévue concernant son utilisation pour identifier un organisme spécifique ou pour un usage clinique (y compris, mais sans s’y limiter, à des fins diagnostiques, pronostiques, thérapeutiques ou dans les banques du sang). Il incombe plutôt à l’utilisateur ou – dans tous les cas de revente des produits – au revendeur de contrôler et de veiller à ce que les produits de purification d’ADN/ARN/protéines de MACHEREY‑NAGEL soient utilisés pour une application bien définie et spécifique. MACHEREY‑NAGEL est responsable uniquement des spécifications et des performances des produits MN conformément aux spécifications de contrôle qualité interne, de la documentation du produit et du matériel de marketing. Ce produit MACHEREY‑NAGEL est livré avec une documentation précisant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La seule obligation de MACHEREY‑NAGEL et le seul recours du client se limitent au remplacement gratuit des produits qui n’offriraient pas les performances garanties. Il est également fait référence aux conditions générales de vente MACHEREY‑NAGEL, qui sont imprimées sur la liste tarifaire et dont un exemplaire sera remis sur simple demande. MACHEREY‑NAGEL ne saurait être tenu responsable : des dommages ou défauts se produisant pendant le transport et la manipulation (hors assurance expédition du client), ou par suite d’un accident ou d’une utilisation impropre ou anormale du présent produit ; des défauts des produits ou des composants non fabriqués par MACHEREY‑NAGEL ; MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 05 9 Purification des réactions de séquençage ni des dommages résultant de tels produits et composants de fabricants autres que MACHEREY-NAGEL ; pour lesquels il n’existe aucune garantie. MACHEREY‑NAGEL n’accorde aucune autre garantie d’aucune sorte, et DÉCLINE ET EXCLUT SPÉCIFIQUEMENT TOUTE AUTRE GARANTIE DE TOUTE SORTE OU NATURE QUE CE SOIT, DIRECTEMENT OU INDIRECTEMENT, EXPRESSE OU IMPLICITE, Y COMPRIS, SANS S’Y LIMITER, RELATIVE AU CARACTÈRE APPROPRIÉ, À LA REPRODUCTIBILITÉ, LA DURABILITÉ, L’ADAPTATION À UN BUT OU UN USAGE PARTICULIER, LA QUALITÉ MARCHANDE, L’ÉTAT OU TOUT AUTRE SUJET EN CE QUI CONCERNE LES PRODUITS MACHEREY‑NAGEL. MACHEREY‑NAGEL ne saurait en aucun cas être tenue pour responsable en cas de réclamations pour tout autre dommage, qu’il soit direct, indirect, fortuit, compensatoire, prévisible, consécutif ou particulier (y compris, mais sans s’y limiter, la perte d’utilisation, de revenus ou de profits), que ce soit sur la base d’une garantie, d’un contrat, d’un délit civil (y compris la négligence) ou d’une responsabilité stricte découlant de la vente ou du défaut d’exécution d’un produit MACHEREY‑NAGEL conformément aux spécifications énoncées. La garantie est exclusive et MACHEREY‑NAGEL ne donne aucune autre garantie expresse ou implicite. La garantie fournie dans le présent document et les données, spécifications et descriptions de ce produit MACHEREY‑NAGEL figurant dans les catalogues publiés et la documentation sur le produit de MACHEREY‑NAGEL sont les seules représentations de MACHEREY‑NAGEL concernant le produit et la garantie. Aucune autre déclaration ou représentation, écrite ou orale, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations écrites signées par un agent dûment agréé par MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisée ; le client ne doit pas se fier à de telles déclarations ou représentations, lesquelles ne font pas partie du contrat de vente ou de la présente garantie. Les allégations relatives au produit sont susceptibles d’être modifiées. Nous vous invitons par conséquent à contacter notre service d’assistance technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur habituel, pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les applications mentionnées dans la documentation fournie par MACHEREY‑NAGEL le sont uniquement à titre informatif. MACHEREY‑NAGEL ne garantit pas que toutes les applications ont été testées dans les laboratoires de MACHEREY‑NAGEL, avec les produits MACHEREY‑NAGEL. MACHEREY‑NAGEL ne garantit en aucun cas le caractère correct de ces applications. Dernière mise à jour : 07/2010, Rév. 03 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel.: +49 24 21 969‑270 tech-bio@mn‑net.com Marques déposées : BigDye® est une marque déposée par Applied Biosystems NucleoSEQ® est une marque déposée par MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. 10 MACHEREY-NAGEL – 06/2022, Rev. 05 www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 52355 Düren · Germany DE CH FR US Tel.: +49 24 21 969-0 Tel.: +41 62 388 55 00 Tel.: +33 388 68 22 68 Tel.: +1 888 321 62 24 info@mn-net.com sales-ch@mn-net.com sales-fr@mn-net.com sales-us@mn-net.com A0xxxx/xxxx.xx