MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis Manuel d’utilisation User manual Extraction des ARN n NucleoSpin® RNA Plus XS Décembre 2022 / Rev. 07 www.mn-net.com www.mn-net.com Extraction des ARN Résumé du protocole (Rev. 07) NucleoSpin® RNA Plus XS 1 Homogénéiser et lyser l’échantillon 100 μL LB1 Homogénéiser 100 μL LB2 100 x g, 2 Éliminer l’ADNg et filtrer le lysat 2 min 11,000 x g, 10 s 3 Ajuster les conditions de fixation 150 μL BSXS 4 Fixer l’ARN Charger le lysat Mélanger 300 x g, 1 min 11,000 x g, 10 s 5 Laver et sécher la membrane de silice 1er lavage 100 μL MDB 11,000 x g, 10 s 2ème lavage 500 μL WB2 11,000 x g, 10 s 3ème lavage 200 μL WB2 < 20,000 x g, 2 min 6 Eluer l’ARN 10 – 20 μL RNase-free H2O 11,000 x g, 1 min MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · support@mn-net.com · www.mn-net.com Extraction des ARN Table of contents 1 Composants 4 1.1 Contenu du kit 4 1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur 5 1.3 Environnement de travail exempt de RNases 5 1.4 A propos de ce manuel 6 2 Description du produit 7 2.1 Principe général 7 2.2 Caractéristiques du kit 7 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons 9 2.4 Procédures d’élution 10 2.5 Stabilité de l’ARN purifié 10 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 11 4 Instructions de sécurité 12 4.1 Elimination des déchets ® 12 5 Protocole NucleoSpin RNA Plus XS 13 6 Annexes 16 6.1 Élimination de l’ADN 16 6.2 Guide de résolution des problèmes 18 6.3 Informations de commande 21 6.4 Restrictions de l’utilisation / garantie 22 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 3 Extraction des ARN 1 Composants 1.1 Contenu du kit NucleoSpin® RNA Plus XS 10 preps 740990.10 50 preps 740990.50 250 preps 740990.250 Tampon de lyse LB1 6 mL 6 mL 30 mL Tampon de lyse LB2 6 mL 6 mL 30 mL Solution de fixation BSXS 10 mL 10 mL 50 mL Tampon de lavage MDB 10 mL 10 mL 30 mL Tampon de lavage WB2 (concentré) 6 mL 12 mL 50 mL H2O RNase-free 13 mL 13 mL 13 mL Colonnes NucleoSpin® gDNA Removal XS (anneau jaune) 10 50 250 Colonnes NucleoSpin® RNA Plus XS (anneau bleu clair plus tube collecteur) 10 50 250 Tube collecteur (2 mL) 20 100 500 Collection Tube (1.5 mL) 10 50 250 Notice d'utilisation 1 1 1 REF 4 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Extraction des ARN 1.2 Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur Réactifs • Éthanol à 96 – 100 % (pour préparer le tampon de lavage WB2, il est recommandé d’utiliser de l’éthanol non dénaturé) Consommables • Tubes de 1,5 mL ou 2,0 mL ou tubes de réaction PCR (pour préparer les lysats) • Micro pilon à usage unique (Optionnel, pour l’homogénéisation de l’échantillon) • Cônes stériles exempts de RNases • MN Bead Tubes Type A ou C (Optionnel, voir Informations de commande) Equipement • Pipettes manuelles • Vortex • Centrifugeuse pour microtubes • Équipement pour le broyage et l’homogénéisation des échantillons (voir le chapitre 2.3). • Équipements de protection individuelle (p.e., blouse, gants, lunettes) Note : des agents réducteurs supplémentaires (p.e. ß-mercaptoéthanol, DTT, TCEP) ne sont pas nécessaires pour les préparations NucleoSpin® RNA Plus XS. 1.3 Environnement de travail exempt de RNases Les composants du kit ont été testés pour garantir l’absence de RNases. Cependant, un environnement de travail exempt de RNases est également un facteur critique pour la réussite de l’extraction et de la manipulation de l’ARN. Il convient donc de suivre les recommandations générales visant à éviter la contamination par les RNases : • Maintenir une zone séparée, des pipettes et du matériel exempts de RNases lorsque l’on travaille avec de l’ARN. • Porter des gants pour manipuler l’ARN et les réactifs afin d’éviter tout contact avec la peau, qui est une source de RNases. Changer fréquemment de gants. • Utiliser des tubes en plastique stériles exempts de RNases. Des tubes collecteurs (2 mL, pour récupérer les filtrats et 1,5 mL pour l’élution) sont fournis dans le kit. Les tubes pour la préparation du lysat doivent être fournis par l’utilisateur. • Utiliser l’eau RNase-free fournie avec le kit pour l’élution. • Garder tous les composants du kit dans leur emballage et tous les contenants hermétiquement fermés en dehors des étapes de pipettage. MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 5 Extraction des ARN 1.4 A propos de ce manuel Il est fortement recommandé de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce manuel d’utilisation si le kit NucleoSpin® RNA Plus XS est utilisé pour la première fois. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire de référence rapide pendant l’exécution de la procédure de purification. Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante : www.mn-net.com. Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes. 6 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Extraction des ARN 2 Description du produit 2.1 Principe général Le kit NucleoSpin® RNA Plus XS est conçu pour purifier l’ARN à partir de petites quantités de divers types de cellules et de tissus. Ce kit contient la colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS qui permet d’éliminer rapidement et efficacement l’ADN génomique sans étape de digestion à la DNase. L’un des aspects les plus importants lors de l’extraction de l’ARN est d’empêcher la dégradation de l’ARN. Les cellules et les tissus sont d’abord lysés par incubation dans un tampon de lyse fortement concentré en ions chaotropiques (LB1 + LB2), qui inactive immédiatement les RNases. Le lysat est ajouté à la colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS (anneaux jaunes) pour clarifier le lysat et éliminer l’ADNg contaminant. Après l’ajout de la solution de fixation BSXS au filtrat, l’ARN est fixé à la colonne NucleoSpin® RNA Plus XS (anneaux bleu clair). Les étapes de lavage ultérieures éliminent les sels, les métabolites et les composants cellulaires macromoléculaires. L’ARN de haute qualité est élué avec du H2O RNase-free. La préparation de l’ARN à l’aide des kits NucleoSpin® RNA Plus XS peut être effectuée à température ambiante. L’éluat doit être traité avec soin car l’ARN est très sensible aux traces de contamination par les RNases, souvent présentes sur le matériel de laboratoire, les doigts et la poussière. Garder l’ARN congelé à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -70 °C pour un stockage à long terme afin de garantir la stabilité de l’ARN. 2.2 Caractéristiques du kit • Les kits NucleoSpin® RNA Plus XS sont recommandés pour l’extraction d’ARN à partir de petites quantités de cellules en culture et de tissus. Les kits NucleoSpin® RNA Plus XS permettent la purification d’ARN de haute qualité. Le rapport ARN A₂₆₀/A₂₈₀ est généralement supérieur à 1,9 (mesuré dans un tampon TE, pH 7,5). • L’ARN purifié est prêt à être utilisé dans diverses applications en aval. • L’ARN purifié avec le kit NucleoSpin® RNA Plus XS est d’une grande intégrité. L’indice d’intégrité de l’ARN (RIN) ou l’indice de qualité de l’ARN (RQN) de l’ARN purifié à partir d’échantillons frais de haute qualité (p.e. cellules eucaryotes ou foie de souris frais) est généralement supérieur à 8. Toutefois, l’intégrité de l’ARN dépend fortement de la qualité de l’échantillon et d’une concentration suffisante d’ARN. • Les molécules d’ARN purifées avec le kit NucleoSpin® RNA Plus XS sont d’une taille supérieur à 100 nucléotides. Ainsi, le kit NucleoSpin® RNA Plus XS permet un enrichissement en ARNm et en ARNr. L’ARN purifié avec les kits NucleoSpin® RNA Plus XS peut contenir d’infimes quantités d’ADN génomique en raison du relatguage de ces molécules de la colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS. La probabilité de détection de l’ADN contaminant par PCR augmente avec : 1. Le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique < cible plastidiale / mitochondriale < plasmides transfectés dans les cellules. 2. la diminution de la taille de l’amplicon PCR. MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 7 Extraction des ARN Tableau 1 : Résumé des caractéristiques du kit Paramètres NucleoSpin® RNA Plus XS Technologie Système avec 2 colonnes à membrane de silice : 1. colonne XS pour l’élimination de l’ADN 2. Colonne XS pour l’extraction de l’ARN Utilisation Réserver à l’usage de la recherche Format Mini colonne à centrifuger - Modèle XS Procédure Manipulation manuelle et centrifugation Échantillon < 10⁵ cellules en culture < 5 mg de tissu Taille du fragment > 100 nt Rendement typique 10⁵ cellules HeLa : environ 500 – 2000 ng 10⁴ cellules HeLa : environ 50 – 200 ng 10³ cellules HeLa : environ 5 – 20 ng 10² cellules HeLa : environ 0,5 – 2 ng 10¹ cellules HeLa : environ 0,05 – 0,2 ng 1 cellule HeLa : environ 0,005 – 0,02 ng 5000 µg de foie : environ 300 – 500 ng 500 µg de foie : environ 300 – 500 ng 50 µg de foie : environ 100 – 250 ng 5 µg de foie : environ 25 – 70 ng 0,5 µg de foie : environ 2,5 – 8 ng 0,05 µg de foie : environ 0,25 – 1,2 ng 0,005 µg de foie : 0,025 – 0,2 ng A260/A280 1.9 – 2.2* A260/A230 1.5 – 2.5* Niveau d’intégrité de l’ARN (RIN) > 8* Volume d’élution 5 – 30 µL Temps de préparation 18 min/6 preps Capacité de fixation 110 µg *La qualité de la détermination des rapports dépend fortement d’une quantité suffisante d’ARN mesurée. Veiller à utiliser une quantité suffisante d’ARN qui a été validée pour permettre une détermination significative du rapport ! 8 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Extraction des ARN 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons La quantité maximale d’échantillon pouvant être utilisée avec le kit NucleoSpin® RNA Plus XS dépend du type d’échantillon et de sa teneur en ARN et en ADN. Quantité maximale d’échantillon à utiliser par préparation (valeurs approximatives) : • Cellules eucaryotes (p.e., cellules HeLa) : 105 cellules • Tissu animal : 5 mg (poids humide) p.e. foie, rein, ou 1 mg rate (poids humide) Stockage des échantillons et inhibition des RNases Les RNases dégradent rapidement l’ARN contenu dans les échantillons si ceux-ci ne sont pas protégés de l’activité des RNases après la collecte. • Utiliser l’échantillon fraîchement collecté pour une lyse immédiate et une purification de l’ARN. • Conserver les échantillons dans le tampon de lyse après broyage à -70 °C jusqu’à un an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou à température ambiante jusqu’à plusieurs heures. Les échantillons congelés dans le tampon de lyse doivent être décongelés lentement avant de commencer l’extraction de l’ARN. • Congeler rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide immédiatement après la récolte et le conserver à -70 °C. Les échantillons congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé. Veiller à ce que l’échantillon ne soit pas décongelé avant d’entrer en contact avec le tampon de lyse. • Submerger et conserver les échantillons dans la solution de stabilisation NucleoProtect® RNA ou RNAlater®. Veiller à une imprégnation complète de l’échantillon avec la solution de stabilisation avant de le congeler. Retirer l’excès de solution de stabilisation de l’échantillon avant l’extraction de l’ARN conformément au manuel d’utilisation de la solution de stabilisation. Broyage et homogénéisation de l’échantillon Cellules adhérentes Aspirer complètement le milieu de culture cellulaire et ajouter immédiatement le tampon de lyse LB1 dans la boîte de culture cellulaire. L’élimination de milieu doit être complète afin de permettre une activité de lyse optimale du tampon de lyse. Pour la lyse, vortexer vigoureusement les cellules. Trypsiniser les cellules adhérentes en croissance : Aspirer le milieu de culture cellulaire et ajouter une quantité équivalente de PBS afin de laver les cellules en culture. Aspirer le PBS. Ajouter 0,1 – 0,3 % de trypsine dans du PBS et incuber pendant une durée appropriée pour détacher les cellules de la surface de la boîte. Après le détachement des cellules, ajouter le milieu de culture cellulaire, transférer les cellules dans un tube approprié (non fourni) et les culotter par centrifugation pendant 5 min à 300 x g. Retirer le surnageant et poursuivre l’ajout du tampon de lyse au culot cellulaire. MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 9 Extraction des ARN Cellules en suspension Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g, éliminer complètement le surnageant et ajouter directement le tampon de lyse LB1 au culot cellulaire. Vortexer vigoureusement pour la remise en suspension et la lyse. Échantillons de tissus • Le broyage peut être effectué par des billes MN Bead Tubes Type A ou C (voir informations de commande). En combinaison avec un Vortex-Genie® 2, les tubes peuvent être montés sur un MN Bead Tube Holder (voir informations de commande). Ajouter l’échantillon et le tampon de lyse LB1 dans le tube de billes et agiter pendant 5 min. Les MN Bead Tubes Type A peuvent également être utilisés avec un broyeur à billes. Il n’est pas recommandé d’utiliser les MN Bead Tubes Type C avec un broyeur à billes. Cela peut être nécessaire pour certains types de tissus (p.e., poumon, tissu cardiaque). La durée et la fréquence optimales doivent être déterminées expérimentalement. Il est recommandé de réduire la quantité de billes dans le tube d’environ 400 µL à environ 70 µL-100 µL de billes afin de permettre un retrait efficace du lysat du tube de billes. • Les pistons pour microtubes peuvent être utilisés pour homogénéiser du matériel congelé ou du matériel frais dans le tampon de lyse LB1 directement dans un tube de microcentrifugeuse. Pour les échantillons de tissus, le lysat doit être clarifié par centrifugation pendant 3 min à 5000 x g. Le surnageant est prêt à être utilisé pour le protocole NucleoSpin® RNA Plus XS. Pour les cellules cultivées, une clarification n’est généralement pas nécessaire 2.4 Procédures d’élution Il est recommandé d’utiliser des volumes d’élution compris entre 5 et 30 µL. Le volume d’élution par défaut est de 10 – 20 µL. 2.5 Stabilité de l’ARN purifié L’ARN élué doit toujours être conservé sur de la glace pendant le travail pour une stabilité optimale. La contamination par des RNases presque omniprésentes (sur du matériel de laboratoire, les doigts, la poussière) peut entraîner la dégradation de l’ARN purifié. Pour un stockage à court terme, congeler l’ARN à -20 °C, pour un stockage à long terme, congeler à -70 °C. 10 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Extraction des ARN 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention : Les tampons LB1, LB2 et MDB contiennent du sel chaotropique. Porter des gants et des lunettes ! ATTENTION : Les tampons LB1, LB2 et MDB contiennent du sel chaotropique qui peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation des échantillons. • Tous les composants du kit doivent être conservés entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels. Avant de débuter une procédure NucleoSpin® RNA Plus XS, préparer les éléments suivants : • Tampon de lavage WB2 : ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 – 100 % (voir tableau ci-dessous) au tampon WB2 concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que de l’éthanol a été ajouté. Le tampon de lavage WB2 peut être conservé à 15 – 25 °C pendant au moins un an. • Si nécessaire, aliquoter l’eau RNase-free dans des tubes de 1,5 mL exempt de RNases (non fournis) afin d’éviter une contamination accidentelle de l’eau par la RNases en cas d’ouverture répétée du flacon. NucleoSpin® RNA Plus XS REF Tampon de lavage WB2 (concentré) 10 preps 740990.10 50 preps 740990.50 250 preps 740990.250 6 mL Ajouter 24 mL d’éthanol 12 mL Ajouter 48 mL d’éthanol 50 mL Ajouter 200 mL d’éthanol MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 11 Extraction des ARN 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® RNA Plus XS, porter des vêtements de protection appropriés (p.e. une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Attention : Le thiocyanate de guanidinium contenu dans les tampons LB1 et LB2 peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné à de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons. Les déchets générés par le kit NucleoSpin® RNA Plus XS n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est très improbable en raison du traitement par tampon de lyse fortement dénaturant, mais elle ne peut pas être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales. 12 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Extraction des ARN 5 Protocole NucleoSpin® RNA Plus XS Avant de débuter la procédure : Vérifier si le tampon de lavage WB2 a été préparé conformément au chapitre 3. 1 Homogénéiser et lyser l’échantillon Broyer et clarifier l’échantillon selon l’une des méthodes décrites au chapitre 2.3 en utilisant 100 µL de tampon de lyse LB1. 100 μL LB1 Homogénéiser 100 μL LB2 Cellules Ajouter LB1 et vortexer vigoureusement. Tissus Homogénéiser en présence de LB1 en utilisant un pilon de microtube ou par broyage avec des billes. Clarifier les lysats de tissus par centrifugation pendant 3 min à 5000 x g. Si un culot visible est observé, il est recommandé de transférer le surnageant dans un tube frais et de jeter le culot. Note : Le tube de lyse n’est pas inclus dans le kit. L’ajout d’un agent réducteur (p.e. ß-mercaptoéthanol, DTT ou TCEP) n’est pas nécessaire. Ajouter un volume de tampon de lyse LB2 au lysat (typiquement 100 µL) et mélanger. Note : 100 µL de LB1 suffisent pour la lyse d’échantillons d’un volume < 20 µL (p.e., 1 mg de tissu ou des suspensions de cellules à faible titre). Pour la procédure d’échantillons plus importants (p.e. suspensions cellulaires de > 20 µL) ou si un volume de lysat plus important est souhaité (p.e. pour le broyage avec les billes), augmenter proportionnellement les volumes de tampon de fixation LB1, LB2 et de solution de fixation BSXS. Attention, il ne faut pas dépasser 180 µL de LB1 (+ 180 µL de LB2 + 270 µL de BSXS) en raison du volume restreint de la colonne et du tube collecteur. Si des volumes plus importants de LB1 (REF 740368.30) et LB2 (REF 740369.30) sont utilisés, du tampon supplémentaire doit être commandé séparément, voir 6.3 Informations de commande. MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 13 NucleoSpin® RNA Plus XS 2 Éliminer l’ADNg et filtrer le lysat Placer une colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS (anneau jaune) dans un tube collecteur (2 mL, fourni), transférer le lysat homogénéisé (~200 µL) dans la colonne et centrifuger pendant 2 min à 100 x g suivi de 10 s à 11 000 x g. Jeter la colonne et poursuivre le filtrat. 100 x g, 2 min 11,000 x g, 10 s Note : S’assurer qu’il ne reste plus de liquide sur la membrane de la colonne après la centrifugation. Si nécessaire, répéter la centrifugation jusqu’à ce que tout le liquide ait traversé la membrane. La faible vitesse de centrifugation permet une élimination performante de l’ADN génomique.. 3 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN Ajouter 150 µL de solution de fixation BSXS (1,5 volume par rapport au LB1) au filtrat et bien mélanger par en vortexant de manière modérée ou par pipetages successifs. 150 μL BSXS Mélanger Note : Si le mélange se fait par vortex, il faut faire attention à ne pas renverser de liquide, car le tube collecteur ne dispose pas de couvercle. 4 Fixer l’ARN Transférer la totalité du lysat (~350 µL) dans la colonne NucleoSpin® RNA Plus XS (anneau bleu clair) préassemblée avec un tube collecteur. lcharger le lysat 300 x g, 1 min Centrifuger pendant 1 min à 300 x g suivi de 10 s à 11 000 x g. Note : Le filtrat peut rester dans le tube collecteur. 14 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 11,000 x g, 10 s NucleoSpin® RNA Plus XS 5 Laver et sécher la membrane de silice 1er lavage 100 μL MDB Ajouter 100 µL de tampon de lavage MDB sur la colonne. Centrifuger pendant 10 s à 11 000 x g. Jeter le filtrat avec le tube collecteur et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur de 2 mL (fourni). 2ème lavage Ajouter 500 µL de tampon WB2 sur la colonne. 11,000 x g, 10 s 500 μL WB2 Centrifuger pendant 10 s à 11 000 x g. Jeter le filtrat et réutiliser le tube collecteur. 3ème lavage Ajouter 200 µL de tampon WB2 sur la colonne. 11,000 x g, 10 s 200 μL WB2 Centrifuger pendant 2 min à pleine vitesse (< 20 000 x g) pour sécher la membrane. Placer la colonne dans un tube collecteur (1,5 mL, fourni). < 20,000 x g, 2 min Note : Si, pour une raison quelconque, le niveau de liquide dans le tube collecteur a atteint la colonne après la centrifugation, jeter le filtrat et centrifuger à nouveau. 6 Eluer l’ARN Ajouter 10 – 20 µL de H2O RNase-free et centrifuger 1 min à 11 000 x g. 10 – 20 μL RNase-free H2O Note : Le volume d’élution peut varier de 5 µL à 30 µL. 11,000 x g, 1 min MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 15 NucleoSpin® RNA Plus XS 6 Annexes 6.1 Élimination de l’ADN Si les échantillons à forte teneur initiale en ADN sont analysés par des applications en aval très sensibles à la contamination par l’ADN, une digestion supplémentaire de l’ADN peut s’avérer nécessaire. Le protocole pour les traitements à la DNase est donné ci-dessous. Protocole A : digestion de l’ADN en solution 1 Digérer l’ADN (préparation de la réaction) Ajouter 1 µL de tampon de réaction pour la rDNase et 0,1 µL de rDNase à 10 µL d’ARN élué. Note : On peut aussi mélanger au préalable 100 μL de tampon de réaction pour la rDNase et 10 μL de rDNase et ajouter 1/10 de volume à un volume d’éluat d’ARN. Agiter doucement le tube afin de mélanger la solution. Centrifuger doucement (environ 1 s à 1 000 x g) pour recueillir chaque gouttelette de la solution au fond du tube. 2 Incuber l’échantillon Incuber pendant 10 min à 37 °C. 3 Repurifier l’ARN Repurifier l’ARN à l’aide d’une procédure de purification de l’ARN appropriée, par exemple en utilisant les kits NucleoSpin® RNA Clean-up ‑ou NucleoSpin® RNA Cleanup XS (voir 6.3 Informations de commande), ou par précipitation à l’éthanol. Précipitation de l’éthanol, à titre d’exemple : Ajouter 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 2,5 volumes d’éthanol 96 – 100 % à un volume d’échantillon. Mélanger soigneusement. Incuber de quelques minutes à quelques heures à -20 °C ou 4 °C. Note : Choisir des temps d’incubation longs si l’échantillon contient une faible concentration d’ARN. Des temps d’incubation courts sont suffisants si l’échantillon contient une forte concentration d’ARN. Centrifuger pendant 10 min à vitesse maximale. Laver le culot d’ARN avec de l’éthanol à 70 %. Sécher le culot d’ARN et remettre l’ARN en suspension dans du H₂O RNase-free. 16 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Extraction des ARN Protocole B : digestion de l’ADN sur colonne 1 Reconstitution de la rDNase Ajouter 4 mL de tampon de réaction pour la rDNase dans un flacon de rDNAse de taille F et dissoudre la DNase. 2 Digestion sur colonne Suivre la procédure de purification conformément au paragraphe 5 jusqu’à ce que la colonne ait été lavée avec 100 µL de tampon de lavage MDB (étape 5). Appliquer 95 µL de mélange réactionnel rDNase directement au centre de la membrane de silice de la colonne. Incuber à température ambiante pendant 15 min. Poursuivre la procédure 5.1, étape 5, en ajoutant 200 µL de tampon WB2 sur la colonne. MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 17 Extraction des ARN 6.2 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possibles et suggestions Contamination par des RNases • ARN dégradé / Pas d’ARN Créer un environnement de travail exempt de RNases. Porter des gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de gants fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes en polypropylène stériles et jetables. Garder les tubes fermés dans la mesure du possible pendant la préparation. La verrerie doit être autoclavée pendant au moins 2 heures à 250 °C avant d’être utilisée. Qualité insuffisante de l’échantillon • Contrôler la collecte, le stockage et la lyse des échantillons. Veiller à ce que les échantillons soient récoltés, stockés et lysés de manière adéquate afin de préserver l’intégrité de l’ARN. Voir le chapitre 3. Mauvaise utilisation ou stockage inadéquat des réactifs Faible qualité ou rendement de l’ARN • Les réactifs n’ont pas été correctement préparés. Ajouter le volume indiqué d’éthanol à 96 % au tampon WB2 concentré et mélanger. • L’échantillon et les réactifs n’ont pas été complètement mélangés. Toujours vortexer vigoureusement après l’ajout de chaque réactif. • Aucune solution de fixation BSXS n’a été ajoutée après la lyse. La liaison de l’ARN à la membrane de silice n’est efficace qu’en présence de la solution de fixation. Stockage du kit • Conserver les composants du kit à température ambiante. Le stockage à basse température peut provoquer une précipitation de sel. • Garder les bouteilles bien fermées afin d’éviter l’évaporation ou la contamination. Ajuster le rendement et la pureté de vos acides nucléiques www.mn-net.com/de/nucleic-acid-fine-tune 18 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Extraction des ARN La force ionique et le pH influencent l’absorption de l’A260 ainsi que le rapport A260/A280. Pour les mesures d’adsorption, utiliser 5 mM Tris pH 8.5 comme diluant. Voir aussi : • Manchester, K L. 1995. Valeur des rapports A260/A280 pour la mesure de la pureté des acides nucléiques. Biotechniques 19, 208 – 209. • Wilfinger, W W, Mackey, K et Chomczyski, P. 1997. Effet du pH et de la force ionique sur l’évaluation spectrophotométrique de la pureté des acides nucléiques. Biotechniques 22, 474 – 481. Faible qualité ou rendement Échantillons de l’ARN (suite) • L’échantillon n’a pas été stocké correctement. Dans la mesure du possible, utiliser du matériel frais. Si ce n’est pas possible, congeler rapidement les échantillons dans de l’azote liquide. Les échantillons doivent toujours être conservés à -70 °C. Ne jamais laisser les tissus décongeler avant l’ajout du tampon de lyse LB1. Effectuer le broyage des échantillons dans de l’azote liquide. Il est également possible d’utiliser des solutions de stabilisation de l’ARN pour protéger l’ARN de la dégradation (p.e. NucleoProtect® RNA ; voir informations de commande). • Broyage et/ou homogénéisation insuffisants des échantillons. Assurer un broyage complet de l’échantillon. Contaminationdu thiocyanate de guanidinium Faible rapport A₂₆₀ / A₂₃₀ • Charger soigneusement le lysat dans la colonne NucleoSpin® RNA Plus XS et éviter une contamination de la partie supérieure de la colonne et du couvercle de la colonne. • S’assurer qu’une quantité / concentration suffisante d’ARN est utilisée pour la quantification afin que la valeur A230 soit significativement plus élevée que le bruit de fond. • La mesure d’une faible quantité / concentration d’ARN entraînera des valeurs instables du rapport A260/A230. Échantillon Colonne NucleoSpin® colmatée / Faible qualité ou rendement de l’ARN • Utilisation d’une trop grande quantité d’échantillons. Une surcharge peut entraîner une diminution du rendement global. Réduire la quantité d’échantillon ou utiliser un plus grand volume de tampon de lyse. • Broyage et/ou homogénéisation insuffisants du matériel de départ. Veiller à un broyage complet de l’échantillon et utiliser la colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS pour l’élimination de l’ADN et pour faciliter l’homogénéisation du matériel de départ broyé. • Augmenter la force g et la durée de centrifugation si nécessaire. MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 19 Extraction des ARN Trop de matériel cellulaire utilisé • Réduire la quantité de cellules ou de tissus utilisés. Le système de détection de l’ADN est trop sensible • La colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS permet de réduire efficacement la contamination par l’ADN. Toutefois, il n’est pas possible de garantir que l’ARN purifié est exempt à 100 % d’ADN ; par conséquent, dans des applications très sensibles, il peut encore être possible de détecter de l’ADN. La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente avec : - le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique < cible plastidiale / mitochondriale < plasmide transfecté dans les cellules - diminution de la taille de l’amplicon PCR. • Utiliser si possible des cibles PCR plus grandes (p.e. > 500 bp) ou des amorces encadrant des introns. • Utiliser le protocole additionnel 6.1 pour la digestion de la rDNase en solution. Contamination de l’ARN par l’ADN génomique Contamination par de l’éthanol ou du sel • Ne pas laisser le filtrat toucher la sortie de la colonne après le deuxième lavage au tampon WB2. Veiller à centrifuger à la vitesse correspondante pendant la durée correspondante afin d’éliminer complètement le tampon éthanolique WB2. Performance • Vérifier que le tampon WB2 a été équilibré à la température ambiante sous-optimale avant utilisation. Le lavage à des températures plus basses réduit de l’ARN l’efficacité de l’élimination des sels par le tampon WB2. dans les expériences en Conserver correctement l’ARN purifié aval • L’ARN élué doit toujours être conservé sur de la glace pour une stabilité optimale, car les traces de contamination par les RNases omniprésentes (sur le matériel de laboratoire, les doigts, la poussière) seront susceptibles de dégrader l’ARN purifié. Pour un stockage à court terme, congeler à -20 °C, pour un stockage à long terme, congeler à -70 °C. Trop d’échantillons Contamination excessive en ADNg • A : Utiliser 150 µL de LB1 et 50 µL de LB2 au lieu d’un rapport 1 :1. Ceci réduira la contamination par l’ADNg, mais également le rendement ARN. Cependant le ratio ARN/ADN sera amélioré. • B : Effectuer une digestion de l’ADN en solution ou sur colonne conformément au paragraphe 6.1. Conserver correctement l’ARN purifié 20 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Extraction des ARN LB2 non appliqué Pas de rendement en ARN 6.3 • Pour des résultats optimaux, la lyse doit être effectuée dans le LB1, puis le lysat doit être mélangé avec un volume de LB2. Si seule la LB1 est utilisée, l’ADN et l’ARN se fixeront à la colonne NucleoSpin® gDNA Removal XS. Informations de commande Produit REF Conditionnement ® 740990.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 ® NucleoSpin RNA Plus 740984.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoZOL 740404.200 200 mL NucleoSpin RNA Plus XS NucleoSpin® RNA Set for NucleoZOL 740406.50 50 ® 740948.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 ® NucleoSpin RNA Clean-up XS 740903.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 rDNase Set 740963 1 Tubes collecteurs 740600 1000 Tampon de lyse LB1 740368.30 30 mL Tampon de lyse LB2 740369.30 30 mL MN Bead Tubes Type A 740786.50 50 MN Bead Tubes Type C 740813.50 50 MN Bead Tube Holder 740469 1 NucleoProtect® RNA 740400.50 / .250 / .500 50 / 250 / 500 mL NucleoSpin RNA Clean-up MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 21 Extraction des ARN 6.4 Restrictions de l’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés à d’autres fins. La description de l’utilisation prévue des produits se trouve dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez respecter les instructions d’utilisation et les consignes de sécurité de la fiche de données de sécurité respective du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL est accompagné d’une documentation indiquant les spécifications et autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit qu’il répond aux spécifications indiquées. La garantie fournie est limitée aux spécifications des données et aux descriptions figurant dans la documentation originale de MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration ou représentation, écrite ou orale, par les employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations écrites signées par un responsable dûment autorisé de MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisée. Le consommateur ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de cette garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenus en rapport avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL dans leur dernière édition, qui peuvent être consultées sur le site Web de l’entreprise. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leurs applications sont susceptibles d’être modifiés. Par conséquent, veuillez contacter notre équipe de service technique pour obtenir les dernières informations sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre distributeur local pour obtenir des informations scientifiques générales. Les descriptions figurant dans la documentation de MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel.: +49 24 21 969‑333 support@mn‑net.com Marques déposées / clause de non-responsabilité : RNAlater® est une marque déposée d’AMBION, Inc. NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG Vortex-Genie® 2 est une marque déposée de Scientific Industries. Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. 22 MACHEREY-NAGEL – 12/2022, Rev. 07 Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 info@mn-net.com CH +41 62 388 55 00 sales-ch@mn-net.com FR +33 388 68 22 68 sales-fr@mn-net.com US +1 888 321 62 24 sales-us@mn-net.com ">
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