Inmed Microscopes Mode d'emploi

Rev : 22-05-2013
Microscopie en transmission
(Plein champs)
et éléments d’optique
François MICHEL PhD
La microscopie pour débutants (ou pas)
Partie 1
Quelques images de microscopie
1 mm
0.1 mm
0.5 mm
F. Michel 22.05.13
Quelques images de microscopie
F. Michel 22.05.13
Illumination standard
Contraste de phase
Contraste interférentiel
différentiel
Bright field
Phase contrast
Nomarski contrast
- DIC
Quelques images de microscopie
Cresyl
D.A.B
F. Michel 22.05.13
Ce qui vous attend
F. Michel 22.05.13
 Généralités
 Illumination
 Détection
 Aberrations et détérioration de l’image
 Résolution et acquisition d’image
 Amélioration des contrastes
Généralités
Buts multiples de la microscopie :
– rendre les détails visibles à l'œil
humain ou par caméra
– séparer les détails dans l'image,
– Mesurer/détecter un signal lumineux,
– produire une image agrandie de
l'objet observé.
Souvent, l’observation s’effectue en fin
de chaîne après l’expérience et la
préparation des échantillons : Il faut
tenir compte du type d’observation
prévu dés le début du protocole.
F. Michel 22.05.13
Généralités
F. Michel 22.05.13
• Un objet n’est observable que par la lumière qui en émane.
• Cette lumière est générée :
– Par transmission, elle traverse l’échantillon
– Par émission (source secondaire : fluorescence) après
excitation (par une source lumineuse primaire ou autres
sources d’énergie).
• Un microscope se décompose donc en deux parties :
– L’illumination
– La détection
Illumination
Détection
Généralités
F. Michel 22.05.13
Microscopes droits
Caméra
Détection
Illumination
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Généralités
Microscope inversé
Condenseur
Oculaires
Illumination
Diascopique
=
transmission
Objectifs
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Généralités
Ordres de grandeur
1 km
103
100 m
102
10 m
10
1m
1
10 cm
10-1
1 mm
10 µm
100 nm
1 nm
10 pm
1 cm
100 µm
1 µm
10 nm
1Å
10-2
10-3 10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9 10-10 10-11
Vision directe
Loupe binoculaire
Microscopie photonique Super-résolution
Microscope électronique
AFM
Généralités
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Nature de la lumière et optique
L’optique est la branche de la physique qui traite de la lumière, de ses relations
avec la matière et avec la vision.
Discipline ancienne datant de l’antiquité (Grèce, Egypte...)
 Dans un premier temps basée sur l’optique géométrique : propagation
rectiligne des rayons lumineux, elle explique réflexions et réfractions
(Al-Hazem - Kepler - Snell - Descartes).
 Fin XVIIème, début des hostilités sur la nature de la lumière entre :

La vision corpusculaire qui aboutira à l’optique quantique au XXème
siècle (Aristote - Euclide - Newton – Planck – Einstein ; couleur, énergie)

L’optique ondulatoire à partir du XVIIIéme (Huygens - Young - Fresnel –
Maxwell ; diffraction, interférence, polarité) .
 La dualité onde/corpuscule est reconnue en 1927 par N. Bohr et clos le
débat donnant naissance à l’électrodynamique quantique.
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Généralités
Nature de la lumière et optique
La lumière est donc composée de photons : γ
qui se propagent de façon rectiligne comme
une onde électromagnétique (Maxwell,1870) .
Géométrique
Ondulatoire
=λ
Electromagnétique
Quantique
La longueur d’onde donnant la couleur du rayonnement.
Longueur d’onde λ (en nm)
X
UV
IR radio
400
500
600
700
Généralités
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Physiologie visuelle (rappels ?!?)
La limite de résolution de l’œil est due à la structure de la
rétine : Les images de deux points doivent se former sur
deux récepteurs distincts pour ne pas être confondues.
L'écartement minimal de deux récepteurs étant de 2,2 µm,
la limite de résolution dépend d’un grand nombre de
facteurs, en conditions normales, elle est d’environ
3.10-4 radian = 1' d’arc soit <150 µm à une distance de 25 cm.
Bâtonnets
Rétine +/- 300 µm
Le fond de l’œil ou rétine est tapissé de
deux types de cellules photosensibles.
Les cônes détectent les couleurs (faibles
sensibilité) et les bâtonnets à forte
sensibilité (niveaux de gris).
Cônes bleus
Cônes verts
Cônes rouges
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Généralités
Trajet optique : lentille (convergente)
f
Les rayons passant par le centre
ne sont pas déviés.
Les rayons parallèles à l’axe
optique passent par le foyer
image.
Conditions de Gauss : Les rayons traversent le système,
sont peu inclinés sur l'axe du système (rayons paraxiaux)
et proche du centre optique.
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Généralités
Optique géométrique (rappels ?!?)
B
A
f
f’
A’
O
B’
Plus l’objet est proche du foyer
plus l’image est grande.
Si l’objet est avant le foyer,
l’image est inversée
Grandissement de la lentille :
Lumière
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Généralités
Optique géométrique (rappels ?!?)
Objet au foyer
B
f
A
f’
Lumière
O
Image inversée à l’infinie
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Généralités
Optique géométrique (rappels ?!?)
Objet entre le foyer et la lentille
B’
B
A’
f
f’
A O
Image virtuelle dans le sens AB
Lumière
Généralités
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Combinaison lentille & œil
Microscope simple (loupe) : image
perçue par l'œil comme si elle était à
une distance de 25 centimètres
25 cm
Lentille
simple
(loupe)
Objet
réel
L’image apparaît du même côté de
l'objectif que l’objet, et ne peut pas
être projetée sur un écran : image
virtuelle (droite, non inversée).
La lumière transmise à travers la
tranche entre dans la lentille pour être
réfractée et focalisée et produire
l’image perçue par la rétine.
Image
virtuelle
f
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Généralités
Interfaces et réfraction
α2
α1
α3
α1
n1
n2
n1 > n2
n1
n3
n1 < n3
n1 sinα1 = n2 sinα2
Loi de Snell-Descartes
Nature 455 p 299 : Farewell to Flatland by Ortwin Hess
Généralités
Interfaces et réfraction
sinα1 = n2/n1 (sinα2)
Exemple : α1 = 30° nair/nverre =1/1,52
α2 = 19,2°
Air
Verre
α1
α2
nair
nverre
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Valeurs approchées de n,
l’indice optique, pour
quelques substances
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Généralités
Interfaces et réfraction n : indice optique
n = c/ν donc n≥1
c : vitesse de la lumière dans le vide
ν : la vitesse de propagation de l'onde dans le milieu traversé
νvide = c= 299 792 458 m·s-1 ≈νAir= 299 704 764 m·s-1
Donc nvide=1 et nair=1.0002926
νEau= 224841533 m·s-1
νVerre= 197603687 m·s-1
donc neau=1.33335
donc nverre=1.51714
α2 = 22.02°
α2 = 19,24°
ν = f(ε, µ) = f(λ, P, T…)
εµν2 = 1
ε : permittivité diélectrique
μ : perméabilité magnétique
Généralités
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Principe du microscope optique
Plan image intermédiaire
L'objectif (L1) donne de l'objet AB observé une image réelle A’B’ renversée
et très agrandie qui joue pour l'oculaire (L2) le rôle d'objet réel. L'oculaire
donne de cet objet une image virtuelle agrandie, vue par l'observateur à
l’infinie car A’B’ est au foyer F2 de l’oculaire.
Généralités
Composants du microscope
• Statif
• Condenseur
• Objectifs
• Oculaires /caméra
Concepts importants
• Ouverture numérique
• Résolution
• Aberrations
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Ce qui vous attend
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 Généralités
 Illumination
 Détection
 Aberrations et détérioration de l’image
 Résolution et acquisition d’image
 Amélioration des contrastes
Illumination
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Sources de lumière
La source de lumière en microscopie de transmission
a longtemps été le soleil ou une bougie.
Elle est maintenant constitué d’une lampe halogène
à filament de tungstène 12 V.
L’illumination par LED blanches devient de plus en
plus courante.
Illumination
Condenseur
La fonction du condenseur est de concentrer
la lumière sur l’objet.
Les microscopes d'initiation sont le plus
souvent dépourvus de condenseur, auquel est
substitué un miroir concave ou des LEDs
blanches.
Le champ éclairé par le condenseur doit être
uniforme.
L'ouverture numérique du condenseur joue
sur la qualité de l'illumination de l'objet.
Idéalement, elle devrait correspondre à celle
de l'objectif (il existe des condenseurs à
immersion pour les objectifs d'ON >1)
F. Michel 22.05.13
F. Michel 22.05.13
Illumination
Illumination critique
Echantillon
Source
lumineuse
Lentille collectrice
(Miroir concave)
Plan objet
Image de la source
Objectif
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Illumination
Illumination critique
C’est la méthode la plus simple. Elle consiste à focaliser la lumière de la source
sur l’objet. L’inconvénient majeur est que la source n’est généralement pas
homogène et par conséquent, l’échantillon ne sera pas éclairé uniformément
ce qui induit des aberrations tels que des effets de bords (bords sombres).
C’est la méthode de choix pour les faibles éclairements (flamme, soleil, lampe).
Objectif
Diaphragme
d’ouverture
Condenseur
Illumination
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Illumination critique
Mauvais réglages du diaphragme d’ouverture du condenseur :
A) la pupille d’entrée de l’objectif n’est pas entièrement couverte (perte de
résolution) ou B) toute la lumière n’entre pas (perte de luminosité et de contraste).
A
B
Illumination
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Illumination de Köhler
Diaphragme de champs
Diaphragme
d’ouverture
Condenseur
Réglage essentiel:
- assure un éclairage homogène de la préparation
- contribue à l’obtention de la meilleure
résolution latérale
- intervient sur la profondeur de champ et le
contraste de l’image
Objectif
August Köhler
(1866-1948)
Illumination
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Disposition des diaphragmes
Boîtier lumière
transmise à
lampe halogène
Diaphragme de
champ
Vis de centrage
du condenseur
Filtres gris
(densités
neutres) et/ou
colorés
Mise au point
axiale du
condenseur
Diaphragme
d’ouverture
Condenseur
Microscope
inversé
Illumination
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Réglages de Köhler (à faire pour chaque objectif)
1) Mettre
au point
sur une
préparation à faible grossissement,
les deux diaphragmes grands ouverts.
2) En dehors de l’échantillon, fermer
le diaphragme de champ pour
visualiser une tache lumineuse
polygonale, floue et non centrée.
Illumination
Réglages de Köhler
3) Rendre nette cette tâche en jouant sur la
hauteur du condenseur (bords polygonaux)
4) Centrer ce polygone dans le champ à l’aide
des vis de centrage du condenseur
F. Michel 22.05.13
F. Michel 22.05.13
Illumination
Réglages de Köhler
5) Ouvrir le diaphragme de champ jusqu’à la limite de
perception dans l’oculaire (tangentiel) pour
vérifier le centrage puis l’ouvrir un peu plus.
6) Fermer légèrement le diaphragme d’ouverture si
besoin est, pour contraster.
fermé
médian
ouvert
F. Michel 22.05.13
Illumination
illumination
détection
Trajet optique
Réglage optimal de
• lampe + collecteur
• diaphragmes
• condenseur
• objectif
• oculaires
Ce qui vous attend
F. Michel 22.05.13
 Généralités
 Illumination
 Détection
 Aberrations et détérioration de l’image
 Résolution et acquisition d’image
 Amélioration des contrastes
Détection
F. Michel 22.05.13
Objectifs
60x 1.4 NA
Lamelle
Milieu de montage
Huile
Objet
Lame
Détection
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Objectifs
Objet complexe, fragile et couteux (de 500 à plus de 20 000 €), central dans la
chaîne optique, sa qualité (sa propreté) et ses caractéristiques influent
directement sur l’image obtenue.
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Détection
Caractéristiques techniques des objectifs
 Marques : incompatibles entre elles (vissage, optiques, corrections…)
 Grandissement : de 2.5 à 150X faîtes votre choix (code couleur, zoom…)
 Ouverture numérique : résolution, luminosité…
 Milieu(x) d’immersion : sec, eau, huile (ONmax respective : 0.95 – 1.2– 1.47)
 Type (corrections des aberrations) : planéité, chromaticité…
 Propriétés optiques spéciales : contraste de phase, DIC…
 Épaisseur de lamelle : normalement 170 µm (réglable quelquefois, attention
aux microscopes inversés (pétri = plastique épais))
 Distance de travail : de la lentille d’entrée de l’objectif au point focal
(de 150 µm à plusieurs millimètres) *
 Profondeur de champs : épaisseur de la "coupe optique", dépend de l’ON*
* Non indiqué sur l’objectif
Détection
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Ouverture numérique
• L’Ouverture Numérique : ON=n.sin(θ) où n est l’indice optique et θ le
demi-angle du cône de détection (Numerical Aperture : NA).
• L’ON n’est pas liée au grandissement, il y a des ON fortes à faible
grandissement comme le 20X sec Zeiss de 0,8 ou des 20X immersion eau
Olympus 0,95 et plus récemment Zeiss et Leica de 1,05 d’ON.
• Plus l’ON est grande, meilleure est la résolution (Res(nm) = 0.61 λ/ON)
• Une mauvaise illumination induit une ON dégradée.
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Détection
Milieux d’immersions : n dans la pratique
L'inhomogénéité des indices réduit le pouvoir résolutif du microscope
et peu induire des aberrations chromatiques ou autres (n=f(λ..))
n = 1.52
n = 1.52
n=1.52
n=1.52
n = 1.52
Objectif
Huile
Air
n = 1.0
n = 1.52
Lamelle
Objet
Eau
n=1.33
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Détection
Profondeur de Champ
Distance entre le point le plus haut et le point le plus bas de la préparation qui
donne une image nette (épaisseur de la tranche optique).
Dépend de l’ouverture numérique : la profondeur de
champ diminue lorsque l’ouverture numérique augmente.
nλ
PdC =
ON 2
Ex. à 488 nm : 5,4 µm pour un objectif sec x10 (ON 0,3)
0,378 µm à l’objectif x63 à immersion huile (ON 1,4)
L’ON
d’un
microscope
en
transmission dépend des ON de
l’objectif mais aussi du condenseur :
le diaphragme d’ouverture limite le
cône d’illumination et donc l’ON.
Fermé (fort contraste)
Ouvert (forte résolution)
Ce qui vous attend
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 Généralités
 Illumination
 Détection
 Aberrations et détérioration de l’image
 Résolution et acquisition d’image
 Amélioration des contrastes
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Aberrations et détérioration de l’image
Les aberrations optiques sont des écarts aux conditions de Gauss
• Aberrations monochromatiques
– Sphérique
– Coma
– Astigmatisme
– Courbure de champs
– Distorsion
• Aberrations chromatique
– Longitudinale
– Latérale
L’image d’un point n’est pas un point !
On y reviendra plus tard…
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Aberrations et détérioration de l’image
Sphériques
Les rayons lumineux qui passent à la périphérie ne convergent pas
au même endroit que les rayons qui passent au voisinage de l’axe.
F. Michel 22.05.13
Aberrations et détérioration de l’image
Coma
L’image d’un point lorsque la lentille n’est pas perpendiculaire à l’axe
optique (tilt) apparaît comme une comète.
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Aberrations et détérioration de l’image
Astigmatisme
L‘image d’un point hors axe apparaît comme un bâtonnet;
Il y a deux foyers dus à l’asymétrie du montage.
F. Michel 22.05.13
Aberrations et détérioration de l’image
Géométriques / courbure de champs
L’image d’un plan n’est pas un plan, mais une
surface sphérique concave (lentille convergente)
ou convexe (lentille divergente).
F. Michel 22.05.13
Aberrations et détérioration de l’image
Chromatiques (axiales et latérales)
La distance focale d’une lentille dépend l’indice optique n et donc de λ.
F. Michel 22.05.13
Aberrations et détérioration de l’image
Correction des aberrations :
• limitation des bords des lentilles (diaphragme de champs, Gauss)
• lentilles non sphériques (difficiles à usiner, optique adaptative)
• association de lentilles de courbures différentes (doublet, triplet…).
Type
d’objectifs
Achromat
Plan Achromat
Fluorite
Plan Fluorite
Plan Apochromat
Aberrations
Sphériques
1 Couleur
1 Couleur
2-3 Couleurs
3-4 Couleurs
3-4 Couleurs
Aberrations Courbure de
Chromatique champs
2 Couleurs
Non
2 Couleurs
Oui
2-3 Couleurs
Non
2-4 Couleurs
Oui
4-5 Couleurs
Oui
Toutes ces aberrations peuvent être corrigées par associations de
lentilles et/ou traitement des surfaces :
Les objectifs de microscope sont compliqués, fragiles et coûteux.
Ce qui vous attend
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 Généralités
 Illumination
 Détection
 Aberrations et détérioration de l’image
 Résolution et acquisition d’image
 Amélioration des contrastes
F. Michel 22.05.13
Résolution et acquisition d’image
Interférences
Géométrique
Ondulatoire
Electromagnétique
Quantique
Chaque onde est caractérisée par une phase et une amplitude. Deux
ondes peuvent se superposer si elles ont la même direction de
propagation et le même plan de vibration,
elles vont créer des interférences.
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Résolution et acquisition d’image
Diffraction
La lumière est diffractée quand elle rencontre un obstacle à sa propagation
(exemple une ouverture), cela va changer sa phase et/ou son amplitude.
La diffraction de la lumière est variable en fonction de la taille de
l’ouverture et de la longueur d’onde.
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Résolution et acquisition d’image
Tout système optique dégrade l’image source à travers une
Fonction de Dispersion d’un Point (PSF)
PSF
source
Système
α
2
1
0
1 2
Optique
Y
X
Z
Plan focal
X
Tâche d’Airy
L’image d’un point n’est pas un point !
Résolution et acquisition d’image
F. Michel 22.05.13
La résolution optique est la capacité d’obtenir l’image de deux
points distincts en deux objets (PSF) individualisables.
Les deux tâches de Airy apparaîtront
comme séparées uniquement si la
différence de niveau entre leurs
courbes d'énergie est suffisamment
grande pour être discernée par le
détecteur (œil, caméra…) donc
séparés d'une distance au moins égale
au rayon du disque d'Airy :
Critères de Rayleigh
d≥
1,22λ
ON (obj ) + ON (cond )
R fluo =
1,22λ 0,61λ
=
2ON
ON
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Résolution et acquisition d’image
La PSF et la résolution sont fonction de l’ON
ON =0,12
ON =0,34
A 488nm
Résolution
XY en µm
ON =0,87
5X sec
10X sec
ON= 0.15 ON= 0.3
1.984
0.992
La résolution dépend de l’ON
et non du grandissement
20X sec 40X huile 60X eau
ON=0.8 ON=1.3
ON=1.2
0.372
0.229
0.248
60X huile
ON=1.4
0.212
Résolution et acquisition d’image
Construction de l’image
N points
1 point
2 points
5 points
Source
PSF
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Résolution et acquisition d’image
F. Michel 22.05.13
Résolution axiale (théorique)
2λ
n 2λ
R xz = ON sin α = ON 2
Pour
5X sec
10X sec
488 nm ON= 0.15 ON= 0.3
Résolution
43.378
10.844
XZ en µm
α
8.6°
17.5°
20X sec
ON=0.8
40X huile 60X eau
ON=1.3
ON=1.2
60X huile
ON=1.4
1.525
0.878
0.901
0.757
53.1°
58.8°
64.5°
67.1°
 ON 
Pour mémoire α = sin −1 

 n 
F. Michel 22.05.13
Résolution et acquisition d’image
Détection
Dans un microscope l’image que l’on observe est un agrandissement
de l’image virtuelle issue de l’objectif (2 étapes).
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Résolution et acquisition d’image
Oculaires
• Essentiellement une fonction de lentille
de projection avec un grossissement de
5x à 20x.
• On ajuste la distance inter-pupillaire à sa
morphologie, de même chaque oculaire
doit être réglé à sa propre vue.
• L'image est nette à +/- 1 cm de la lentille
de sortie (les œilletons en caoutchoucs
servent à créer cet espace et éviter de
salir la lentille).
• On peut ajouter dans le trajet optique
des
filtres
ou
des
grilles
positionnement ou de comptage.
de
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Résolution et acquisition d’image
Caméras CCD (Charged Coupled Device)
Caractéristiques d’une caméra
 La résolution spatiale
 La résolution temporelle : Sensibilité, architecture du transfert, binning
 Le rendement quantique (q<1) : lié aux matériaux, la technique et à la λ
 Les bruits de fond
 La dynamique
 La linéarité : importante pour les étude quantitatives
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Résolution et acquisition d’image
Lum
Echantillonnage spatial
Taille du pixel optimal (Nyquist-Shannon) = résolution/2,3 : Cela permet d’avoir un minima
entre les maximas quelque soit la position des pixels (cadre de lecture).
Exemple pour un 100X 1.4 d’ON à 488 nm
Résolution 212 nm
taille du pixel optimum ≈92 nm
Taille réelle 6.45 µm /100 donc 64.5 nm
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Résolution et acquisition d’image
Ratio S/B et Dynamique
Bruits de fond :
• Bruit de Photon:
dû aux caractéristiques de la
lumière incidente
• Bruit d’obscurité :
génération d’e- par effet
thermique
• Bruit de lecture : généré par
l’électronique de la caméra
La dynamique :
liée au bruit de fond et à la capacité des puits
de potentiels (binning)
(ex : 5 105 e-/10 e- soit 5000:1 adaptée à une
image 12 bits 4096 niveaux de gris)
Ce qui vous attend
F. Michel 22.05.13
 Généralités
 Illumination
 Détection
 Aberrations et détérioration de l’image
 Résolution et acquisition d’image
 Amélioration des contrastes
Autres mode d’Illumination
F. Michel 22.05.13
• Fond noir
• Contraste de phase
• Contraste Interférentiel Différentiel (DIC)
Autres mode d’Illumination
F. Michel 22.05.13
Fond noir
Photons
diffusés
Surfaces
réfléchissantes
Condenseur
spécial
Filtres
occultants
Seul les photons diffractés/diffusés par
l’échantillon sont transmis et captés par l’objectif
du fait de l’illumination structurée.
Combinaison d’images en fond noir et d’ illumination polarisée
Avec l’autorisation du Dr Steve Edgley
http://www.pdn.cam.ac.uk/groups/edgleylab/index.html
Autres mode d’Illumination
F. Michel 22.05.13
Contraste de phase
- L’œil humain est uniquement capable de voir des
différences d’intensité (amplitude) ou de couleur (λ).
- Les objets biologiques microscopiques sont souvent très
transparents et donc peu contrastés car le flux lumineux
transmis par les différentes parties des cellules est
similaire.
Fritz Zernicke,
Prix Nobel (1953).
Inventeur du
contraste de phase
- Par contre, l’indice optique des différents compartiments
cellulaires est très variable ce qui induit des différences de
vitesse des ondes donc des retards de phase des ondes.
- But : transformer des différences de phase en différences
d’intensité
F. Michel 22.05.13
Autres mode d’Illumination
Contraste de phase
Longueur
d’onde (λ)
∆ϕ
Lumière directe
+
Interférences
=
0-2π
Lumière diffractée
Echantillon
Déphasage de λ/4
π/2
3π/4
π
En moyenne un échantillon biologique entraine un déphasage de λ/4
(π/2 en cosinus).
les interférences sont trop faibles pour induire un contraste décelable.
Autres mode d’Illumination
F. Michel 22.05.13
Contraste de phase
Ondes en
opposition de
phase (λ/2)
Echantillon
Lame de phase
Déphasage de λ/4 supplémentaire
=
3π/4
0-2π
π/2
π
Pour obtenir un contraste maximal, il faut créer l’interférence en
déphasant la lumière diffractée uniquement de λ/2.
Autres mode d’Illumination
Condenseur
Anneau
de phase
F. Michel 22.05.13
Contraste de phase
Objectif
Lumière
directe
transmise
Lumière
diffractée
Lame de phase
La lumière directe transmise (annulaire - jaune) est fortement atténuée par le
cercle de la lame de phase et va interférée avec la lumière diffractée (grise sur le
schéma) par l’échantillon pour former un contraste en noir et blanc
(interférences destructive (+λ/4) ou constructive (-λ/4) ).
On obtient donc un déphasage différentiel de λ/2.
F. Michel 22.05.13
Autres mode d’Illumination
Contraste interférentiel différentiel :DIC (Nomarski)
Les prismes de Wollaston séparent la lumière en deux faisceaux de polarisations
perpendiculaires (biréfringence). Lorsqu’ils sont recombinés par le deuxième Wollaston, il y a
des interférences entre les deux rayons en fonction de la différence de leurs chemins
optiques. Il en résulte une lumière grise si le trajet optique a été le même, et blanche ou noire
s’il a été différent, donnant l’illusion d’un éclairage rasant. Ce type de contraste donne un
effet de relief sur des préparations épaisses (idéal pour le patch-clamp).
Polariseur (45°)
Prépare la lumière
pour le premier
Wollaston.
Analyseur (135°)
Bloque la lumières
transmise directe
Prismes de Wollaston
Sépare la lumière incidente
en deux faisceaux de
polarisation croisée
Condenseur
Echantillon Objectif
Prismes de Wollaston
Recombine les deux faisceaux de
polarisation croisée en un seul à
polarisation unique créant des
interférences et du contraste.
la position latérale du prisme influx
sur l’amplitude du contraste.
Autres mode d’Illumination
F. Michel 22.05.13
Comparaison contraste de phase /DIC
Phase
 Compatible avec l’utilisation de boite
plastique
 Sensible au chemin optique parcouru
 Halos (contraste noir/blanc) autour
des objets
 Insensible à l’orientation des
structures (contraste “isotrope”)
DIC
 Limité au verre
 Sensible à des variations d’indice
 Pas de halos autour des objets
 Utilisation optimale de l’ouverture
numérique donc meilleure résolution
Sensible à l’orientation des
structures (effet pseudo-ombrage)
 Plus cher
Fin du premier round
F. Michel 22.05.13
Merci d’avoir tenu jusque là,
Prochaine étape : la microscopie de fluorescence
Géométrique
Ondulatoire
Electromagnétique
Quantique
Commentaires, remarques, améliorations :
francois.michel@inserm.fr
Sources et Ressources
F. Michel 22.05.13
WEB divers
 Molecular expressions http://micro.magnet.fsu.edu/index.html
Microscopy U (Nikon) : http://www.microscopyu.com
Microscopy resource system (Olympus): http://www.olympusmicro.com/index.html
A whole world of microscopy knowledge (Zeiss): http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html
Wikipédia
Plate-formes d’imagerie
 PICSL http://www.picsl.univ-mrs.fr/ : MICROSCOPIE OPTIQUE (PDF indisponible)
 BIC http://www.bic.u-bordeaux2.fr/ : Microscopie à épi-fluorescence et microscopie confocale (PDF)
Membres du GDR2588 CNRS (microscopie fonctionnelle des systèmes vivants) et
du RTmfm (Réseau technique de microscopie de fluorescence multidimensionnelle).
Cours
 Arnaud Sergé (université de la Méditerranée – Marseille II)
Yves Husson (Université Joseph Fourrier – Grenoble)
Serge Monneret (Institut Fresnel, Marseille)
Maxime Dahan (Laboratoire Kastler Brossel, ENS)
François Waharte (institut Curie, UMR144)
Handbooks
Fondamentaux d’optique et d’imagerie numérique à l’usage des microscopistes (C Cibert, ed. Cépaduès)
Handbook of biological confocal microscopy, third edition (JB. Pawley ed. Springer)
Fundamentals of light microscopy and electronic imaging (DB. Murphy, ed Wiley-liss)
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