Hain Lifescience GenoType® Enterococcus Manuel utilisateur

 GenoType® Enterococcus
Extraction et Amplification de l'ADN de l'espèce bac-
terienne Enterococcus ssp.
Introduction
Ce protocole décrit l'amplification par PCR multiplex de fragments d'ADN en vue de l'i-
dentification des espèces enteroccales £. faecalis, E. faecium, E casseliflavus et Е. galli-
Narum ainsi que des genes de resistance à la vancomycine vanÀ, vanS, vanC 1 et vanC2/€7.
La PCR est couverte par des brevets détenus par la sociéte Hoffmann-La Roche,
Aucune autorisation, licence implicite ou explicite pour la pratique de ia PCR ni
aucune autre méthode utilisant la PCR ne sont couvertes en cas d'acquisition de
cette trousse. Les informations sur l'obtention d'une licence pour la pratique de la
PCR où sur d'autres méthodes utilisant ta PCR peuvent être obtenues en contactant
F. Hoffmann-la Roche AG, CH - 4070 Bâle.
Conservation et Précautions
Dés réception, conserver le mélange Amorces/Nucléotides [PNM] & 2-8°C ei isolés
de toute source d'ADN potentiellement contaminante. Si la durée de conservation
doil excéder 4 semaines, conserver à —20%, |L'esi recommandé d'aliquoter le mé-
lange PN afin d'éviter tes congélations/décongélations répétées. Ne pas utiliser les
réactifs au-delà de leur date de péremption.
Tous les échantillons doivent être considérés cormme potentiellement infectieux et
être manipulés comme tel. Observer les précautions usuelles pour la préparation de
l'amplification. It est essentiel que le matériel et les réactifs utilisés pour l'extraction
de l'ADN et pour la préparation de l'amplification soient exempts de DNases. Ne pas
mélanger les réactifs provenant de différents lots de trousses.
Matériel Requis mais Non Fourni
- ADN polymérase thermostable avec tampon (enzyme de type «hot start» recom-
mandée, taux d'extension : (2-4 kb/rnin à 72°C, demi-vie : 10 min à 97°C, 40 min
a 94°C, rendement d'amplification : >105]
- Eau (niveau de pureté pour Biologie Moléculaire}
- Embouts de pipettes stériles avec filtre
- Gants à usage unique :
- Huile minérale, niveau de pureté pour Biologie moléculaire [pour thermocycleur
sans couvercle chauffant]
Micro-tubes pour thermocycleur; exempt de contamination par DNasc et RNase
— Pipetles réglables pour 10, 26, 200, et 1006 pl
- Kéactifs pour l'extraction de l'ADN ainsi que les appareils associés
- Thermocycleur (taux de chauffage : 3°C/sec, taux de refroidissement : 72°C/sec,
précision : +/—0,2°C}
Extraction de l'ADN
Le matériel de départ conseillé pour l'extraction de l'ADN consiste en des bacté-
ries fraîchement cultivées en milieu sotide [minimum de 109 colonies). La pièce
de travail doit être dénuée de tout ADN amplifié. Toute procédure d'extraction
d'ADN bactérien conduisant à de l'ADN amplifiable peut être utilisée.
Le protocole d'extraction rapide décrit ci-après permet également de préparer
l'ADN en vue d'une amplification :
. Prélever jusqu'à 5 colonies à l'aide d'une oeuse et resuspendre dans 156 il d'eau.
. Incuber la suspension bactérienne a 95°C pendant 10 minutes.
. Incuber dans un bain à ultrasons pendant 15 minutes,
Fv Wk =
. Centrituger-pendant 5 minutes à vitesse maximale et utiliser directement 5 jl de
surnageant pour la PCR. Si l'ADN doit être conservé pendant une longue période,
transférer le surrageant dans un nouveau tube.
Préparation de l'Amplification
Préparer le mélange réactionnel [45 pi) dans une pièce exempte d'ADN. L'échan-
tillon d'ADN doit être rajouté dans Une pièce séparée. || est recommandé d'utiliser
une ADN polymerase de lype «hot start». 5i cette enzyme n'est pas utilisée, fous les
pipelages doivent être réalisés sur de la glace.
Préparer le mélange suivant par tube :
- 35 pl de mélange Amorces/Nucléotides [PNM]
5 pil de tampon dincubation de la potymérase 10x —- non fourni
x pl de MgCL" - non fourni
- 1-2 unitéfs] IADN polymérase thermostable (se réferer au manuel] - non fourni
— yuldeau gsp 45 pl thors velume de Uenzyme] - nor fourni
- Ajouter 5 yl de solution d'ADN fraîchement extrait [20-100 ng d'ADN! pour at-
teindre un volume final de 5G pl {hors volume de l'enzyme]
1 Selon le système tampon/enzyme utilisé, la concentration optimale de MgCl, peut
varier de 1,5 à 2,5 mM. A noter que certains tampons contiennent déjà te MgCL,
Déterminer le nombre d'échantillons à amolifier [nombre d'échantillons à analyser +
contrôles]. Pour un contrôle négatif, par exemple, la solution d'ADN à amplifier est
remplacée par 5 jl d'eau. Préparer Une solution mère de mélange réactionnet con-
tenant tous les réactifs à l'exception de ADN, et bien homogénéiser îne pas vortexer].
Si le thermacycleur ne possède pas de couvercle chauffant, recouvrir les échan-
tillons d'huile minérale.
Profil d'Amplification
9 min 95°C - 1 cycle
sec 95° ; |
ЗО вес ос | 10 cycles
2 min h8°C —
25 sec 95% - |
40 sec 53°C - 20 cycles
40 вес TOC -
8 min 70% - 1 cycle
2 La durée de cette étape doit être rallongée en cas d'utilisation d'ADN polymé-
rase de type «hot start» [se référer au manuel de l'enzymei.
Selon le thermocycleur utilisé, Le profil d'amplification peut demander des modi-
fications (contacter votre distributeur]. |
Les produits de l'amplification peuvent être conservés avec +4 à <20°C.
Les amplicons ont une taille de 63 pb [fragment Contrôle Universel}, 248 pb /Ente-
rococeus ssp.f, 131 pb fvand], 51 ph fvanB), 222 pb fvanC1) et 51 pb fvanC2/£3).
L'évaluation des performances du test a été réalisée à l'aide de la Taq polymérase
HotStarTaq fournie par la société Qiagen. |
Fabricant
Hain Lifescience GmbH, Hardwiesenstrafle 1, 72147 Nehren, Allemagne C €
http://www.hain-lifescience.de
12/2003
ЧЕ
me
GenoType® Enterococcus
Test Génetique d'identification des Enterococci
Résistants à ta Vancomycine.
Principe
Le test Genolype® Enteracoccus est basé sur la technologie DNA-«STRIP® et permet
l'identification combinée des espèces enterococcales E faecalis, E faecium, E. cas-
seliflavus et E. gellinarum ainsi que des gènes de résistance à la vancomycine vand,
van5, vanC! et vanC2/C3. La procédure complète comporte trois phases: extraction de
[ADN à partir de cultures (matériel requis pour l'extraction de l'ADN non fournil, une
amplification multiplex a l'aide d'amorces biotinylées [ADN polymérase thermostable
non fournie), et détection de FADN amplifié par hybridation inverse. Cette derniére
phase comporte les étapes suivantes: dénaturation chimique de YVADN amplifié, hy-
bridation des amplicons simples brins biotinylés aux sondes pré-immabilisées sur la
membrane, lavage stringent, et enfin addition d'un conjugué streptavidine / phos-
phatase alcaline sulvie d'une révélation chromogénique. Les signaux obtenus sont fa-
cilement et rapidement interprétés à l'aide d'une matrice fournie avec chaque trousse,
Précautions
Tous les échantitlons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et
être manipulés comme tels. Les échantillons prélevés sur des patients à risques doi-
vent être identifiés et manipulés dans des conditions de sécurité adéquates. Suivre
les recommandations Éfédérale, nationale, locale] d'hygiène, de sécurité et d'envi-
ronment. Se protéger à l'aide de vêtements adéquats et de gants.
Lors de la manipulation du kit, tenir compte des indications de sécurité suivantes :
La Solution de Dénaturation [DEN] contient du NaOH [<2%] et est irritante pour la
peau et les yeux (R36/38 et 526, 537/39, S45).
Le Substrat Concentré [SUB-C] contient du Dimethyl Sulfoxide et est irritante [R36/37/38,
523-26-36).
Pour des informations supplémentaires, consulter les fiches de sécurité.
Contrôle de Qualité
Afin de contrôler le bon déroulement du test et Le bon fonctionnement des réactifs,
chaque bandelette comporte deux zones de contrôle
- Une zone «Contrôle Conjugué» pour contrôler la fixation du conjugué sur la ban-
delette et te bon déroulement de la révélation chromogénique
- une zone «Contrôle Universel» qui détecte, au vue des connaissances actuelles,
toutes les espèces bactériennes. Puisqué l'échantillon de départ étant une culture
bactérienne, cette zone doit toujours développer un signal positif. Lamplification
du contrôle peut néanmoins être atténuer par l'amplification des séquences spé-
cifiques. À noler que cette zone n'est pas un contrôle de PCR puisqu'un échan-
tilon de contrôle de contamination (eau) entraînera un signal négatif dans la zone
«Contrôte Universel».
Procédure
Préparation
Préchauffer Le bain-marie agitateur/TwinCubator® à exactement 45°C +/—1°C. Pré-
chauffer les solutions HYB et STR à 37-45°C avant utilisation. Les réactifs ne dei-
vent présenter aucun précipité [à noter cependant que la solution CON-D est opaque).
5) besoin, agiter Equilibrer les autres réactifs [à l'exception des solutions CON-C et
SUB-C] à température ambiante. Dans un tube approprié, diluer Le Conjugué Con-
centré ICON-C, orange] et le Substrat Concentré (SUB-C, jaune) au 1:100 dans un
volume adéquat du tampon correspondant {CON-C avec CON-D, SUB-~G avec SUB-D).
Bien homogénéiser et équilibrer à température ambiante. Pour chaque échantillon
testé, ajouter 10 pl de concentré à 1 mi de tampon. Diluer CON-C avant chaque
utilisation. Une fois dilué, SUB-C reste stable pendant 4 semaines conservé à term-
pérature ambiante er à l'obscurité.
1. Déposer 20 pl de- Solution de Dénaturation (DEN, bleu] & une extrémité de chaque
puit utilisé.
2, Ajouter 20 jt d'échantillon amplifié et mélanger tes deux solutions par pipe-
tages répétés. Incuber 5 minutes à température ambiante.
Pendant ce temps, à l'aide d'une pince, sortir du tube le nombre approprié de
bandelettes (STRIPS], et inscrire au crayon leur numéro d'identification dans
(espace situé sous la Ligne de repère. Toujours porter des gants pour manipuler
les bandelettes,
3. Ajouter dans chaque puit 1 mt de Tampan d’Hybridation {HYB, vert] préchauffé
et homogénéisé. Homogénéiser jusqu'à ce que te mélange devienne une co-
loration homogène.
Eviter les eclaboussures vers les autres puits.
à. Déposer une bandelette dans chaque puit utilisé.
E, gallinarum
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'ADN
de £. gallinarum.
E. casseliflavus
Le développement d’une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'ADN
de E. casseliflavus. A noter que ADN de E, ftavescens hybride également dans cette
zone de réaction,
van
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence du gène
de resistance à la vancomycine van.
vanB
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence du gène
de résistance a la vancomycine vanB,
vanC1
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indigue la présence du géne
de résistance a la vancomycine van£T.
vanC2/C3
Le développement d’une ligne colorée dans cette zone indique la présence du gène
de resistance á la vancomycine vanC2/C3.
Limitations
En vue de (amplification, (ADN doit être extrait à partir de culture de bactéries à
laide d'une méthode appropriée,
CADN cible doit avoir eté correctement amplifié,
Le test fonctionne dans tes limites de la région du génome choisie pour chaque
sonde. Un séquençage potentiel doit être réalisés séparément.
La présence de différentes espèces bactériennes dans un même échantillon peut
entravée l'interprétation du.test.
Comme dans tout système de détection basé sur l'hybridation, il existe la possibilité
que des variations dans la séquence d'ADN génomique cible et pour lesquelles le
test n'a pas été conçu, entraînent un résultat erroné, En raison de l'extrême variabi-
tite des génomes bactériens, il est possible que certains sous-types puissent ne
pas être détectés. Le test reflète l'état actuel des connaissances de la société HAIN
LIFESCIENCE.
Causes d’Erreurs
Résultats faibles ou absence de signal (incluant ta zone de contréte conjugué)
- Température ambiante trop basse ou réactifs mal équilibrés,
~ CON-C et/ou SUB-C trap dilué où CON-D et/ou SUB-D utilisé sans dilution pré-
alable.
Résultats faibles ou absence de signal, excepté dans la zone de contrôle conjugué
- La qualité et/ou la quantité de l'ADN extrait n’ont pas permis une amplification
correcte. Analyser l'ADN amplifié sur un gel. Si aucun amplicon n'est visible,
répéter les étapes d'extraction et d'amplification. Essayer éventuellement une
autre méthode d'extraction de l'ADN. À noter qué la réaction d'amplification peut
être inhibé par un échantitlon de départ trop concentré.
4"
- Température d' incubation trop élevée.
Signaux faux positifs
- Température d'incubation trop basse.
- Solution d'Hybridation et/ou Solution de Lavage Stringent incorrectement équi-
librés ou homogénéisés.
- Contamination de l'ADN extrait et/ou des réactifs d'amplification avec de l'ADN pré-
cédemment extrait ou amplifié. Lorsque les réactifs d'amplification sont contami-
nés, un contrôle négatif entraîne égatement le développement des lignes tests.
- Dans certaines conditions de test, une forte concentration d'ADN amplifié peut
entraîner une réaction chromogénique très rapide, En pareil cas, afin de pré-
venir le développement de bandes dues à des réactions d'hybridation croisées,
arrêter la réaction chromogénique dès que les premières lignes colorées de-
viennent visibles,
- Contamination des puits voisins par des éclaboussures lors de l'addition du So-
lution d'Hybridation.
- La culture de cépart n'est pas pure,
Coioration non homogène
- Les bandelettes n'ont pas été suffisamment immergées lors des différentes in-
Les bandelettes doívent étre entierement recouvertes par le liquide, avec ta face
sensibilisée (identifiable par la ligne de repére) tournée vers le haut. Les han-
detettes mal arientées doivent étre remises en position à l'aide de pincettes pro-
pres. Afin d'éviter toute contamination, bien nettoyer les pincettes après chaque
utilisation. Cella vaut aussi pour toutes les étapes suivantes,
5. Placer la plaque dans les bain-marie agitateur/TwinCubator* et incuber 30 mi-
nutes à 45°C.
Pour le bain-marie agitateur sélectionner une fréquence d'agitation suffisante pour
assurer un bon brassage du tampon. Ajuster le niveau de Peau dans le bain-marie
agitateur au moins a un tiers de la hauteur des puits de facon à assurer un bon
transfert de chaleur. Cela vaut aussi pour toutes les étapes suivantes.
6. Aspirer le contenu des puits.
Utiliser par exemple une pipette pasteur reliée à une pompe à vide.
7. Ajouter à chaque puit 1 mi de Solution de Lavage Stringent [STR, rouge] et
Incuber 15 minutes à 45°C dans le bain-marie agitateur/TwinCubator®,
&. À partir de cette étape, travailler à température ambiante.
Eliminer La Solution de Lavage Stringent.
Vider la Solution de Lavage Stringent dans un container à déchets, Eliminer tout
le liquide résiduel en retournant tes puits sur du papier absorbant [effectuer de
même pour les autres étapes de lavage].
7. Laver chaque puit avec 1 ml de Sotution de Rincage (RIN) et incuber pendant
une minute sous agitation. Vider la Solution de Rincage.
10. Ajouter a chaque puit 1 ml de Conjugué dilué [voir ci-dessus] et incuber 30 mi-
nutes sous agitation. | On
11.Vider le contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute à l'aide de 1 ml de
Solution de Rincage (RIN); Vider RIN, Répéter ce rinçage une nouvelle fois, puis
rincer Une fois avec environ 1 mt d’eau distiltée à l'aide d’une pissette.
Bien éliminer toute trace d'eau dans les puits après cette dernière étape.
12. Ajouter 1 mi de Substrat dilué [voir ci-dessus) dans chaque puit et incuber sans
agitation à l'obscurité,
Le temps de révélation peut varier en fonction des conditions de déroulement du
test (de 3 à 20 minutes), notamment de la température de la pièce, Des temps de
révélation trop longs peuvent entraîner un bruit de fond qui peut gêner l'inter-
prétation des résultats.
13.Arrêter la réaction en rinçant brièvement deux fois à l'eau distillée.
14.A l’aide de pincettes, récupérer les bandelettes et les sécher entre deux cou-
ches de papier absorbant. ; ;
Lecture et Interpretation des Resultats
Classer et ranger les bandelettes à l'abri de la lumière. Une feuille de lecture est
fournie avec le kit, mais peut également être téléchargée à l'adresse suivante :
http:/Awaw.hain-lifescience.de/pdf/ enterococcus _evaluation.pdf
La matrice fournie avec la trousse permet d'identifier chaque zone réactionnelle
par superposition.
Chaque bandelette comprend 10 zones réactionnetles [voir figure).
—
< Contrôle Conjugué (CC)
T- Contrôle Universel [UC]
“| —— £. faecalis
Ро £ faecium
1 E. gallinarum
ns — E. casseffflavus
M vana
o — vanf
ml ——— van!
qd vanC2/C3
Controle Conjugué (CC)
Une ligne colorée doit se développer dans cette zone. Cette ligne témoigne de la
bonne fixation du conjugué et le bon déroulement de la révélation.
Controle Universel {UC)
Cette zone comprend une sonde s'hybridant au niveau d'une région d'ADN haute-
ment conservée au sein de toutes les espèces bactériennes testées à ce jour. Le
développement d’une ligne colorée dans cette zone indique la présence d'ADN bac-
térien dans l'échantillon testé ainsi qu'une extraction et une amplification de ADN
correctes.
E. faecalis
Le développement d’une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'ADN
de £. faecalis.
E. faecium
Le développement d'une ligne colorée dans cette zone indique la présence de l'ADN
de £. faecium.
cubations.
- Le portoir n'a pas été correctement agité.
Bruit de fond important
- CON-C et/ou SUB-C trop concentré.
- Les étapes de lavage n’ont pas été correctement effectuées.
- Les solutions de lavage étaient trop froides tors de teur utilisation,
Composition du Kit Quantité
Bandelettes sensibilisées avec les sondes
spécifiques [STRIPS] 12 9%
Mélange PN [PNM] ‘в
contient amorces spécifiques des loci testés, Ë |
nucléotides, colorant 05 mb. - 4mi
Solution de Dénaturation [DEN] prét a Pemplor |
contient <2% NaOH, colorant 0,3 mi 247ml
Solution d'Hybridation (HYB] prét a l'emploi
contient 8-10% de détergent anionique, colorant 20 ml 1720 ml
Solution de Lavage Stringent ISTR] prêt à l'emploi
contient 25% d'un sel d'ammonium quaternaire,
<t% détergent anionique, colorant 20 mi 120 ml
Solution de Rincage (RIN} prêt à l'emploi
Milieu tamponné, <1% NaCl, <1% de détergent
anionique 50 ml 360 ml
Conjugué Concentré (CON-C] concentré
contient de la phosphatase alcaline conjugué 4 la
streptavidine, colorant 0,2 ml 1.2 ml
Tampon Conjugué (CON-D) :
Milieu tamponné, 1% agent bloquant, <1% NaCl 20 mi 120 ml
Substrat Concentré (SUB-C) concentré
contient du Dimethyl Sulfoxide, solution substrat 0,2 ml 1,2 mi
Tampon Substrat SUB-D)
Milieu tamponné, <1% MgCL, <1% Nall 20 ml 120 ml
portoir, feuille de lecture 1 dechaque = 4 de chaque
manuel d'utilisation, matrice 1 de chaque = 1 de chaque
Matériel Requis mais Non Fourni
- Bain-marie agitateur/TwinCubator® — Gants 3 usage unique
- EChronomeétre - Papier absorbant
— Eau distillée - Pincettes
- Embouts de pipettes - Pipettes réglables pour 10, 20, 200,
(de préférence stériles avec filtre] et 1000 pl
- Eprouvette Plateau agitateur/TwinCubator®
~ Thermomeftre calibré
Données Techniques
Échantillon requis: culture bactérienne fraîche
Volume nécessaire: 20 pl de solution d'ADN amplifié par échantillon
Durée du test: approximativement 2 heures
28°C: pour conserver >é semaines, le mélange
‚р 9
PN doivent être conservés à 20°C
Conservation:
Art, No.: 888 12 tests
Art. No.: B88% 196 tests
Fabricant
Haín Lifescience GmbH, HardwiesenstraBe 1, 72147 Nehren, Allemagne C €
http://www.hain-lifescience.de
12/2003
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