Thermo Fisher Scientific PrioCHECK PPV Ab serum pig 7588981 Mode d'emploi

PrioCHECK® PPV Ab
Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques du Parvovirus porcin dans le sérum de porcs
Coffret de 2 plaques pour 176 échantillons
©
Prionics AG
Notice d'utilisation
Version 1.1_f
Introduction
Le parvovirus du porc (PPV) est un petit virus à ADN
simple brin appartenant à la famille des Parvoviridae.
C'est un agent infectieux ubiquitaire qui provoque chez
le porc des troubles de la reproduction, entraînant des
pertes économiques importantes dans l'industrie
porcine à travers le monde. Le PPV est capable de
traverser la barrière placentaire. Les conséquences
d'une infection à PPV dépendent du statut immunitaire
des truies en gestation infectées par le virus. Chez les
truies non immunes, les infections à PPV survenant
ème
jour de gestation peuvent entraîner la
avant le 35
mort de l'embryon. Après le 70ème jour environ, les
fœtus sont immunocompétents et vont pouvoir élaborer une réponse immune en produisant des anticorps
anti-PPV. Ils pourront ainsi survivre à l'infection et le
porcelet qui naîtra sera sain et aura une sérologie
positive en anticorps anti-PPV.
®
Le test PrioCHECK PPV Ab détecte les anticorps
spécifiques à partir du septième jour d'infection. Le
taux d'anticorps atteint un plateau environ 10 jours
après l'infection. Le statut infectieux d'un élevage peut
être déterminé par titrage de 2 échantillons de sérum
prélevés à plusieurs semaines d'intervalle. En fonction
du résultat, la décision de vacciner les porcs pourra
être prise afin de contrôler l'infection à PPV.
Principe du test
®
Le test PrioCHECK PPV Ab est réalisé en effectuant
une seule dilution les échantillons de sérum étant
dilués au 1/5 avant d'être testés.
Les dilutions de sérum sont pré-incubées avec de
l'antigène PPV. Pendant l'incubation, les anticorps
spécifiques, s'ils sont présents, vont former des complexes immuns avec l'antigène. Après l'incubation, le
mélange antigène-anticorps sériques est transféré
dans une microplaque coatée avec un anticorps
spécifique. Au cours d'une seconde incubation, l'antigène PPV non lié va se fixer sur la microplaque coatée
avec l'anticorps spécifique, alors que l'antigène PPV
complexé avec les anticorps présents dans l'échantillon de sérum (= antigène bloqué) ne se fixe pas sur la
microplaque coatée. Après élimination des réactifs non
fixés, le conjugué est distribué dans les puits et se lie
avec l'antigène qui s'est fixé sur les plaques. Ces
dernières sont incubées et lavées et le substrat chromogène (TMB) est ajouté. La coloration est stoppée
au bout de 15 minutes d'incubation et la densité
optique (DO) est mesurée à 450 nm.
Composition du coffret
Conserver le kit à 5±3°C jusqu'à la date d’expirati on
qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée de
conservation des produits du coffret, une fois dilués,
ouverts ou reconstitués, est mentionnée au chapitre
s'y référant (voir ci-dessous).
Les informations sur les risques chimiques sont
données dans le paragraphe « Normes de Sécurité Risque et Sécurité » (Annexe II).
Composant 1
Microplaque
Deux plaques de barrettes sécables.
Composant 2
Conjugué (30x)
(concentré 30x, à diluer avant utilisation).
Un flacon contenant 1,5 ml de conjugué.
Le conjugué dilué n’est pas stable, préparer juste
avant utilisation.
Composant 3
Tampon de dilution (5x)
(concentré 5x, à diluer avant utilisation).
Un flacon contenant 60 ml de tampon de dilution.
Stabilité du tampon de dilution solution de travail:
5 heures à 22±3°C.
Composant 4
Solution de lavage (200x)
(concentré 200x, à diluer avant utilisation). Un flacon
contenant 60 ml de solution de lavage.
Stabilité de la solution de lavage: 1 semaine à 22±3°C.
Composant 5
Eau déminéralisée
Un flacon contenant 10 ml d'eau déminéralisée.
Composant 6
Sérum de cheval (lyophilisé)
Un flacon contenant 3,5 ml de sérum de cheval lyophilisé.
Stabilité du sérum de cheval reconstitué: jusqu’à la
date de péremption à -20°C.
Composant 7
Antigène (lyophilisé)
Deux flacons contenant 6,0 ml d'antigène lyophilisé.
Stabilité de l’antigène reconstitué: en aliquotes jusqu’à
la date de péremption à -20°C.
Composant 8
Sérum de contrôle 1 (prêt à l'emploi)
Un flacon contenant 1,0 ml de sérum de contrôle 1
(sérum de contrôle positif).
Composant 9
Sérum de contrôle 2 (prêt à l'emploi)
Un flacon contenant 1,0 ml de sérum de contrôle 2
(sérum de contrôle négatif).
Composant 10
Substrat chromogène (TMB) (prêt à l'emploi)
Un flacon contenant 60 ml de substrat chromogène
(TMB).
Composant 11
Solution d'arrêt (prête à l'emploi)
Un flacon contenant 60 ml de solution d'arrêt.
Autres composants du coffret:
- Notice d'utilisation
- 1 couvercle pour couvrir les barrettes pendant les
périodes d'incubation
- Certificat d'analyse
Equipement nécessaire mais non
fourni
Equipement général:
Equipement de laboratoire aux normes de sécurité
nationales.
Plaques non sensibilisées
Plaques non sensibilisées pour la dilution des sérums
et pour l'étape de pré-incubation avec l'antigène.
Nous conseillons l'utilisation de plaques à fond rond
(Greiner, réf. 6501101). Mais d'autres plaques ou
tubes (dont la paroi ne fixe pas les complexes immuns) peuvent être utilisés.
Incubation:
Incubateur de microplaque (chauffant au moins à
50°C).
Analyse des résultats:
Lecteur de microplaques: Multiscan EX ou équivalent.
Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire
les plaques à 450 nm.
Equipement optionnel:
Laveur de microplaques: Tecan EIA Tray
Washer ou équivalent.
Pour diagnostic in vitro uniquement
Usage strictement vétérinaire
Conserver à 5±3°C
Produit No.: 7588981
Mode opératoire
Précautions
Les recommandations nationales pour la manipulation
d'échantillons animaux doivent être suivies de façon
®
stricte. Le test PrioCHECK PPV Ab ne doit être
réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela.
Les échantillons doivent être considérés comme
potentiellement infectieux. Tout matériel en contact
avec ces échantillons doit être considéré comme
potentiellement contaminé.
Les informations sur les risques chimiques sont
données dans le paragraphe « Normes de Sécurité Risque et Sécurité » (Annexe II).
Remarques
Pour obtenir des résultats optimums avec Prio®
CHECK PPV Ab, les précautions suivantes doivent
être prises:
Le mode opératoire doit être rigoureusement
suivi.
Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à
T° ambiante (22 ±3°C) avant utilisation.
L'embout des pipettes doit être changé chaque fois
qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé.
Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour
chaque réactif.
Les composants du coffret ne doivent pas être
utilisés après la date de péremption ou si un changement dans leur aspect est observé.
Les réactifs provenant de coffrets portant des
numéros de lots différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests.
Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée
ou une eau équivalente.
SOLUTIONS A PREPARER A L'AVANCE
Solution de lavage
La solution de lavage (200x) (Composant 4) doit être
diluée 1/200 dans de l'eau déminéralisée. La quantité
fournie permet de préparer un volume final de 12
litres. Stabilité de la solution de lavage diluée: 1
semaine à 22±3°C.
Tampon de dilution solution de travail
Diluer le tampon de dilution concentré (5x) (Composant 3) dans 1/5 de l'eau déminéralisée.
Stabilité du tampon de dilution solution de travail: 5
heures à 22±3°C.
Sérum de cheval
1
Reconstituer le sérum de cheval (Composant 6) dans
de l'eau déminéralisée (Composant 5).
Après reconstitution, stocker à -20°C jusqu’à la da te
de péremption.
Tampon du conjugué
Pour 2 barrettes, ajouter à 1,9 ml de tampon de
dilution solution de travail, 0,1 ml de sérum de cheval
reconstitué [concentration finale de sérum de cheval =
5% (v/v)].
Le tampon de conjugué non utilise peut être stocké à
5±3°C pendant 24 heures.
Dilution du Conjugué
Diluer du conjugué (30x) (Composant 2) dans 1/30 le
tampon du conjugué. Pour 2 barrettes: préparer 1.8 ml
de conjugué dilué.
Remarque: La dilution de travail du conjugué doit
être préparée juste avant utilisation.
PrioCHECK® PPV Ab
Antigène
1
Reconstituer l'antigène (Composant 7) avec 6 ml le
tampon de dilution solution de travail.
Si le coffret n'est utilisé que partiellement, l'antigène
reconstitué doit être aliquoté en volumes de 1,0 ml
(pour un maximum de 6 séries de tests par plaque).
Eviter les congélations-décongélations multiples et
conserver l'antigène aliquoté à -20°C.
Remarque: Les lavages peuvent être effectués avec un laveur
automatique ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques peut être fait manuellement avec
200 – 300 µl de solution de lavage par puits. Vider ensuite les
plaques et répéter le lavage autant de fois que spécifié. Il n'est
pas nécessaire d'égoutter les plaques entre les cycles de
lavage. Tapoter fermement les barrettes sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage.
PRE-INCUBATION DES ECHANTILLONS
DE SERUM ET DE L'ANTIGENE
1.1
1.2
1.3
1.4
Mélanger 96 µl de tampon de dilution solution
de travail avec 24 µl de sérum de contrôle 1
(Composant 8) et 120 µl d'antigène reconstitué.
Mélanger 96 µl de tampon de dilution solution
de travail avec 24 µl de sérum de contrôle 2
(Composant 9) et 120 µl d'antigène reconstitué.
Mélanger 12 µl de chaque échantillon de sérum
avec 48 µl de tampon de dilution solution de
travail et 60 µl d'antigène reconstitué.
Incuber 60±5 minutes à 37±1°C.
INCUBATION DANS LA PLAQUE DE REACTION
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
Identifier chaque barrette (Composant 1) avec
un marqueur fin.
Déposer 100 µl de tampon de dilution solution
de travail dans les puits A1 et B1.
Déposer 50 µl de tampon de dilution solution de
travail dans les puits C1 et D1.
Ajouter 50 µl d'antigène reconstitué dans les
puits C1 and D1 et mélanger.
Déposer 100 µl du mélange sérum de
contrôle 1 - antigène dans les puits E1 et F1.
Déposer 100 µl du mélange sérum de
contrôle 2 - antigène dans les puits G1 et H1.
Déposer 100 µl de mélange échantillonantigène dans les autres puits.
Couvrir la plaque avec un film adhésif et
l'incuber 120±5 minutes à 37±1°C.
INCUBATION AVEC LE CONJUGUE
3.1
3.2
3.3
Vider les barrettes et les laver 6 fois avec 200 –
300 µl la solution de lavage. Les tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier
cycle de lavage.
Distribuer 100 µl de conjugué dilué dans tous les
puits.
Couvrir la plaque de barrettes et l'incuber 60±5
minutes à 37±1°C.
INCUBATION AVEC LE SUBSTRAT CHROMOGENE
(TMB)
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
Vider les barrettes après la période d'incubation
et les laver 6 fois avec 200 – 300 µl la solution
de lavage. Les tapoter fermement sur du papier
absorbant après le dernier cycle de lavage.
Distribuer 100 µl de substrat chromogène (TMB)
(Composant 10) dans tous les puits.
Incuber 15 minutes à 22±3°C.
Distribuer 100 µl de solution d'arrêt (Composant
11) dans tous les puits.
Homogénéiser le contenu des puits avant de lire
la densité optique (DO).
Remarque: Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15 minutes
après avoir déposé de substrat chromogène (TMB) dans le
premier puits. Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits
1
-
Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :
Ramener le flacon à 22±3°C.
Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour
s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.
Ouvrir le flacon.
Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée.
Laisser le réactif lyophylisé se reconstituer.
Reboucher le flacon et l'agiter doucement de manière à ce que le
lyophilisat soit entièrement dissout.
Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C.
Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la
formation de mousse).
en gardant le même ordre et le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB).
LECTURE DU TEST ET CALCUL DES RESULTATS
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450
nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la
solution d'arrêt.
Calculer la DO450 moyenne des puits A1 et B1 (=
DO450 blanc).
Calculer la DO450 corrigée des sérums de
contrôle 1 et 2 et des échantillons des sérums
en soustrayant la DO450 blanc.
Calculer la DO450 moyenne des puits C1 and D1
(= DO450 max).
Le pourcentage d'inhibition (PI) est calculé selon
la formule suivante:
Remarque: La DO450 corrigée de chaque échantillon
est exprimée en pourcentage d'inhibition (PI) par
rapport à la DO450 max corrigée
PI = 100-
DO450 corrigée de l'échantillon
----------------------------------------- x 100
DO450 max corrige
INTERPRETATION DES RESULTATS
Validation des critères
6.1 La DO450 blanc (puits A1 et B1) doit être < 0,300.
6.2 La DO450 max corrigée (puits C1 et D1) doit
être > 1,000.
6.3 Le PI du sérum de contrôle 1 (sérum de contrôle
positif) doit être > 50%.
6.4 Le PI du sérum de contrôle 2 (sérum de contrôle
négatif) doit être < 50%.
6.5 Si ces critères ne sont pas validés, les résultats
de la série de tests sont ininterprétables.
Remarque: Si la DO450 max est inférieure à 1,000, de substrat
chromogène (TMB) était peut-être trop froide au moment de
son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de
substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber les barrettes plus
longtemps (sans dépasser 30 minutes d'incubation).
Si la DO450 max corrigée est supérieure à 2,000, il est conseillé
de diminuer le temps d'incubation avec de substrat chromogène
(TMB).
perte économique ou d'un dommage matériel subis par un
client suite à l'utilisation de ses produits.
Prionics AG et Prionics Lelystad BV sont des entreprises
certifiées ISO 9001:2000.
Annexe II
Normes de Sécurité - Risque et Sécurité
Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées
de façon stricte.
Composant 1
Microplaque
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 2
Conjugué (30x)
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 3
Tampon de dilution (prêt à l'emploi)
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 4
Solution de lavage (200x)
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 5
Eau déminéralisée
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 6
Sérum de cheval (lyophilisé)
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 7
Antigène (lyophilisé)
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 8
Sérum de contrôle 1 (prêt à l'emploi)
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 9
Sérum de contrôle 2 (prêt à l'emploi)
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Interprétation du pourcentage d'inhibition
PI ≥ 50%
Positif
Présence d'anticorps spécifiques du PPV dans le
prélèvement.
PP < 50%
Négatif
Absence d'anticorps spécifiques du PPV dans le
prélèvement
Annexe I
Avertissement
Les informations contenues dans cette notice sont considérées
comme étant complètes et exactes au moment de leur publication. Prionics AG ne peut en aucun cas être tenu pour responsable des dommages fortuits ou indirects liés à l'utilisation de
ce document ou en résultant.
Responsabilité
Prionics AG garantit que ses produits sont conformes aux
caractéristiques décrites sous réserve qu'ils soient utilisés selon
les instructions fournies et dans les délais de conservation
indiqués. Prionics AG exclut toute autre garantie, explicite ou
implicite, y compris la garantie d'aptitude à la vente ou de
conformité pour une utilisation particulière. La garantie mentionnée ici, ainsi que les informations, spécifications et descriptions des produits commercialisés par Prionics AG figurant
dans les catalogues Prionics AG ou dans tout autre document,
ne peuvent pas être modifiées, sauf consentement écrit
express de Prionics AG. Les présentations orales ou écrites, ou
les publications non conformes à cette garantie ne sont pas
autorisées et sont sujettes à caution.
En cas de rupture de la garantie, l'obligation de Prionics AG se
limite à la réparation ou à l'échange, à sa discrétion, du produit
ou d'une partie du produit, sous réserve que le client informe
rapidement Prionics AG de cette rupture de garantie. Au cas où
la société Prionics AG ne pourrait pas réparer ou remplacer le
produit ou une partie du produit, elle devra rembourser au client
l'intégralité des sommes perçues pour ce produit ou pour partie
de ce produit.
Prionics AG ne peut être tenu pour responsable des dommages
fortuits, particuliers ou indirects y compris ceux résultant d'une
Composant 10
Substrat chromogène (TMB) (prêt à l'emploi)
Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes
de l'Union Européenne.
Composant 11
Solution d'arrêt (prêt à l'emploi)
Code de risque: R35: Provoque de graves brûlures.
S26: En cas de contact avec les yeux, rincer immédiatement et
abondamment avec de l'eau et consulter rapidement un
médecin.
S36/37/39: Porter un vêtement de protection approprié, des
gants et un appareil de protection des yeux/du visage.
S45: En cas d'accident ou de malaise, consulter rapidement un
médecin (lui montrer l'étiquette du produit si possible).
Annexe III
Références bibliographiques
(1) F. Westenbrink, M.A. Veldhuis and J.M.A. Brinkhof
Journal of Virological Methods, 23 (1989) 169, 178.
Contacts
Prionics Lelystad B.V.
Platinastraat 33
P.O. Box 2271
NL-8203 AG, Lelystad
The Netherlands
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Fax +31 320 714029
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Wagistrasse 27a
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