Thermo Fisher Scientific PrioCHECK BHV-1 gB Ab Strip Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit
Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques de l'herpèsvirus bovin de type 1 dans le sérum et le lait de vache
Référence Catalogue 7610359
Pub. Nº MAN0013868 Rév. A.0
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gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support.
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disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Introduction
L'herpèsvirus bovin de type 1 (BHV-1) est un virus de la sous-famille des Alpha-herpesvirinae, qui est responsable d'une infection virale touchant les
bovins. Cette infection inclut une grande variété de symptômes dont la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR), la vulvovaginite pustuleuse infectieuse (IPV)
et la balanoposthite pustuleuse infectieuse (IPB). Après infection, le virus entre dans une phase de latence. Dans certaines conditions de stress, il peut se
réactiver et être excrété à intervalles irréguliers.
Le dépistage des bovins porteurs du BHV-1 occupe une place essentielle dans les programmes de contrôle de l'infection et dans les activités de commerce
internationales. Il doit donc s'appuyer sur des tests sérologiques très sensibles. Applied Biosystems™ PrioCHECK™ BHV−1 gB Ab Strip Kit qui est un test à
la fois simple, spécifique et très sensible permet de détecter les anticorps dirigés contre la glycoprotéine de surface B du BHV-1. Les échantillons de sérums
étant testés non dilués, le PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit ELISA détecte mieux les taux faibles d'anticorps que le test de neutralisation virale. Les
anticorps peuvent également être détectés dans le lait de tank. PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit constitue donc un outil simple et pratique pour
déterminer le statut des troupeaux de bovins par rapport à l'infection à BHV-1.
Principe du test
PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit est un ELISA compétition. Les microplaques sont coatées avec l'antigène BHV-1. Les sérums non dilués (ou dilués) ou les
échantillons de lait dégraissé (lait de tank) non dilués, sont incubés toute la nuit dans les puits des microplaques coatées avec l'antigène BHV-1. Pendant cette
phase de pré-incubation, les anticorps spécifiques du BHV-1, s'ils sont présents dans l'échantillon, vont réagir spécifiquement avec l'antigène BHV-1. Après
incubation et lavage des plaques, un anticorps monoclonal dirigé contre la gB du BHV-1 et conjugué à la peroxydase est déposé dans les puits. Après le lavage
des puits, le substrat chromogène (TMB) est ensuite ajouté. Le développement de la coloration est stoppé et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm.
Composition du coffret
Coffret de 5 plaques pour 440 échantillons. Conserver le kit à 5±3°C jusqu'à
la date d’expiration qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée de
conservation des produits du coffret, une fois dilués, ouverts ou
reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-dessous).
Composant
Description
Composant 1 : Microplaque
Cinq microplaques.
Composant 2 :
Conjugué (30x)
(concentré 30x, à diluer avant utilisation). Un flacon
contenant 2.5 mL de conjugué. Le conjugué dilué
n’est pas stable, préparer juste avant utilisation.
Composant 3 :
Tampon de dilution (2x)
Concentré 2x, à diluer avant utilisation. Un flacon
contenant 60 mL de tampon de dilution. Stabilité du
tampon de dilution solution de travail : 4 heures à
22±3°C.
Composant 4 :
Solution de lavage (200x)
Concentré 200x, à diluer avant utilization. Un flacon
contenant 60 mL de solution de lavage. Stabilité de la
solution de lavage : 1 semaine à 22±3°C.
Composant 5 :
Eau déminéralisée
Deux flacons, chaque contenant 10 mL d'eau
déminéralisée.
Composant 6 :
Sérum de cheval
Lyophilisé. Cinq flacons, chaque contenant 2.5 mL de
sérum de cheval lyophilisé. Stabilité sérum de cheval
reconstitué : jusqu’à la date de péremption à −20°C.
Composant 7 :
Sérum de contrôle négatif
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 3.0 mL de sérum
de contrôle négatif.
Composant 8 : Sérum de
contrôle positif faible
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 3.0 mL de sérum
de contrôle positif faible.
Composant 9 :
Sérum de contrôle positif
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 3.0 mL de sérum
de sérum de contrôle positif.
Composant 10 : Substrat
chromogène (TMB)
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de
substrat chromogène (TMB).
Composant 11 :
Solution d'arrêt
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de
solution d'arrêt.
Autres composants du
coffret
• Notice d'utilisation
• 10 films adhésifs pour couvrir les plaques
Equipement nécessaire mais non fourni
Description(1)
Use
(1)
Général
Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales.
Incubation
Incubateur de microplaque (chauffant au moins à 50°C).
Analyse des
résultats
Lecteur de microplaques. Le lecteur doit être équipé d'un filtre
permettant de lire les plaques à 450 nm.
Optionnel
Laveur de microplaques.
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Mode opératoire
Précautions
• Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte.
• PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit ne doit être réalisé que dans les
laboratoires équipés pour cela.
• Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement
infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être
considéré comme potentiellement contaminé.
Remarques
Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip
Kit, les précautions suivantes doivent être prises :
• Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi.
• Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22±3°C)
avant utilisation.
• L'embout des pipettes doit être changé chaque fois qu'un nouvel
échantillon ou réactif est prélevé.
• Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif.
• Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de
péremption ou si un changement dans leur aspect est observé.
• Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots
différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests.
• Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau
équivalente.
Solutions à préparer à l'avance
Tampon de dilution solution de travail
Le tampon de dilution (2x) (Composant 3) doit être dilué au 1:2 dans de
l'eau déminéralisée. Pour une plaque : préparer 24 mL (12 mL de tampon
de dilution (2x) + 12 mL d'eau déminéralisée).
Stabilité du tampon de dilution solution de travail : 4 heures à 22±3°C.
Sérum de cheval
Reconstituer le sérum de cheval (Composant 6) avec 2.5 mL de l'eau
déminéralisée (Composant 5). Conserver à −20°C après reconstitution.
Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :
1. Ramener le flacon à T° ambiante (22±3°C).
2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour
s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.
3. Ouvrir le flacon.
4. Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée.
5. Reboucher le flacon et l'agiter doucement de manière à ce que le
lyophilisat soit entièrement dissout.
6. Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C.
7. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la
formation de mousse).
Tampon ELISA
Ajouter le sérum de cheval reconstitué au tampon de dilution solution de travail
pour obtenir une concentration finale de 10% (v/v). Pour une plaque : préparer
24 mL (2.4 mL de sérum de cheval + 21.6 mL de tampon de dilution solution de
travail). Conserver le tampon ELISA non utilisé à 5±3°C pendant 24 heures.
Dilution du Conjugué
Préparer la dilution de travail du conjugué (Composant 2) en diluant le
conjugué (30x) dans le tampon ELISA. Pour une plaque : préparer 10.5 mL
de conjugué dilué.
Remarque : La dilution de travail du conjugué doit être préparée juste
avant utilisation.
Solution de lavage
La solution de lavage (200x) (Composant 4) doit être diluée 1:200 dans de
l'eau déminéralisée. La quantité fournie permet de préparer un volume final
de 12 litres. Stabilité de la solution de lavage diluée : 1 semaine à 22±3°C.
Remarque : Les lavages peuvent être effectués avec un laveur automatique
ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques peut
être fait manuellement avec 200–300 µL de solution de lavage par puits. Vider
ensuite les plaques et répéter le lavage autant de fois que spécifié. Il n'est pas
nécessaire d'égoutter les plaques entre les cycles de lavage. Tapoter fermement
les barrettes sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage.
Remarque : Voir Annexe B pour la préparation et la conservation des
échantillons.
Jour 1 : Incubation des échantillons de sérum dans la plaque
sensibilisée
1. Déposer 100 µL de tampon ELISA dans les puits A1 et B1 les barrettes
(Composant 1).
2. Déposer 100 µL de sérum de contrôle négatif (Composant 7) dans les
puits C1 et D1.
3. Déposer 100 µL de sérum de contrôle positif faible (Composant 8) dans
les puits E1 et F1.
4. Déposer 100 µL de sérum de contrôle positif (Composant 9) dans les
puits G1 et H1.
5. Déposer 100 µL de chaque échantillon dans les autres puits.
- Les sérums peuvent être testés non dilués ou dilués après avoir
effectué des dilutions au 1:2 dans du tampon ELISA.
- Les échantillons de lait dégraissé doivent être testés non dilués.
6. Couvrir la plaque avec un film adhésif fourni dans le coffret.
7. Incuber toute la nuit (16–18 heures) à 37±1°C.
Jour 2 : Incubation avec le conjugue et avec le substrat
chromogène (TMB)
1. Vider la plaque après incubation et la laver 6 fois avec la solution de
lavage. La tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier
cycle de lavage.
2. Distribuer 100 µL de solution de travail du conjugué dans tous les puits.
3. Couvrir la plaque avec un film adhésif fourni dans le coffret.
4. Incuber 60±5 minutes à 37±1°C.
5. Vider la plaque après incubation et la laver 6 fois avec la solution de
lavage. La tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier
cycle de lavage.
6. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) (Composant 10) dans
tous les puits.
7. Incuber 15 minutes à 22±3°C.
8. Distribuer 100 µL de solution d'arrêt (Composant 11) dans tous les puits.
9. Homogénéiser le contenu de la plaque avant de mesurer.
Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15 minutes après avoir
déposé le substrat chromogène. Distribuer la solution d'arrêt dans tous les
puits en gardant le même ordre et le même rythme que pour distribuer le
substrat chromogène.
Lecture du test et calcul des résultats
1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes
suivant l'addition de la solution d'arrêt.
2. Calculer la DO450 moyenne des puits A1 et B1 (= DO450 max).
3. Le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums de contrôle et des
échantillons est calculé selon la formule ci-dessous.
Remarque : La DO450 de chaque échantillon est exprimée en pourcentage
d'inhibition (PI) par rapport à la DO450 max.
PI = 100 − (DO450 de l'échantillon / DO450 max) × 100
Interprétation des résultats
Validation des critères
1. La DO450 max doit être >1.000.
2. Le pourcentage d'inhibition du sérum de contrôle négatif doit être <40%.
3. Le pourcentage d'inhibition du sérum de contrôle positif faible doit être >40%.
4. Le pourcentage d'inhibition du sérum de contrôle positif doit être >70%.
Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont
ininterprétables.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
8 Mars 2019
Remarque : Si la DO450 d'un échantillon est supérieure à la DO450 max, le
pourcentage d'inhibition peut être considéré comme étant égal à 0%.
Si la DO450 max est inférieure à 1.000, de substrat chromogène (TMB) était
peut-être trop froide au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à
ramener la solution de substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber les
barrettes plus longtemps (sans dépasser 30 minutes d'incubation).
Si la DO450 max corrigée est supérieure à 2.000, il est conseillé de diminuer le
temps d'incubation avec de substrat chromogène (TMB).
Interprétation du pourcentage d'inhibition
PI <40%
PI ≥40%
Négatif
Positif
Absence d'anticorps spécifiques du BHV-1
Présence d'anticorps spécifiques du BHV-1
Remarque : Dans le cas d'un titrage, le titre des anticorps est défini comme
l'inverse de la plus grande dilution donnant un PI >40%.
Annexe A – Références
1. Ackermann M, Belak S, Bitsch V, Edwards S, Moussa A, Rockborn G,
Thiry E (1990). Vet Microbiol 23:361–363.
2. Kramps JA, Magdalena J, Quak J, Weerdmeester K, Kaashoek MJ,
Maris-Veldhuis MA, Rijsewijk FAM, Keil G, van Oirschot JT (1994). J of
Clin Microbiol 2175–2181.
3. Kramps JA, Perrin B, Edwards S, van Oirschot JT (1996). Vet Microbiol
53:153–161.
Annexe B – Préparation et conservation des échantillons
Sérum
• Les échantillons de sérum peuvent être conservés à −20°C avant d'être
testés.
• Les sérums à titrer doivent être dilués de 2 en 2 dans du tampon ELISA.
Lait
• Les échantillons de lait dégraissé, qu'ils contiennent ou non un
conservateur (par ex. l'azide de sodium), doivent être préparés par
centrifugation 15 minutes à 1000 × g. Au lieu d'être centrifugés, ils
peuvent être conservés au réfrigérateur pendant au moins 16 heures. Le
prélèvement de lait sera effectué sous la couche de crème qui recouvre
le lait, au moyen d'une pipette Pasteur.
• Avant d'être testés, les échantillons de lait peuvent être conservés à
−20°C une fois dégraissés. Il est également possible de les conserver à
5±3°C plusieurs jours après y avoir ajouté un conservateur (par ex.
l'azide de sodium).
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion
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nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment :
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• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches
Signalétiques))
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits
chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits
selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site
www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous
avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à
l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
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Historique des révisions : Pub. Nº MAN0013868 (français)
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